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(無題) 削除/引用 No.816-10 - 2009/07/14 (火) 02:26:37 - 小児科医師（ゆとり教育） うさん、ご回答ありがとうございます。電子レンジは最近調子が悪いので使うのをやめることにしました。サンプルを加熱してみてサンプルの状態を見たいと思います。

(無題) 削除/引用 No.816-9 - 2009/07/13 (月) 18:39:12 - う 例えば、私は細胞の核だけをサンプルバッファーに溶かしてサンプルとするときがあります。 その時、最初はゼリー状です。 そのサンプルを１０分ほど鍋で煮ると、サンプルがさらりとした液になります。 これはおそらく、DNAがDenatureした為に変化するものと考えられます。 他の小児科医師（ゆとり教育）さんの質問では、サンプルを電子レンジにてあたためているとあります。 一度、鍋のお湯中などで１０分ほどあたためてみてはどうですか？ きっと解決すると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.816-8 - 2009/07/13 (月) 10:19:59 - 小児科医師（ゆとり教育） やむちゃさん、御回答ありがとうございます。 目的蛋白の変性の可能性がやや心配ですが、凍結解凍で粘性を下げることができるのですね。初めて知りました。今後、検討したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.816-7 - 2009/07/12 (日) 02:16:52 - やむちゃ 原因がDNAやったら、ペレットの入ったエッペンドルフチューブをドライアイスで凍結した後、室温で溶解しボルテックス。これを粘性がなくなるまで繰り返すことでも改善されまっせ。

(無題) 削除/引用 No.816-6 - 2009/07/07 (火) 08:14:40 - 小児科医師（ゆとり教育） 皆様、温かいご回答ありがとうございます。「勉強が足りない！」と言われるのではないかとびくびくしておりました。 >>経験者様、AP様 はい、核DNAまたはミトコンドリアDNAが原因だと思います。今のプロトコールではほとんどの核は除けていると思いますが、混入はもちろん可能性があります。 >>み様 ご指摘の通り、ミトコンドリアの量に対してSDSが少ない可能性は考えておりました。ただ、サンプル間でそんなに細胞数が変わらないのに、ゼリー状になるサンプルとならないサンプルがあるので困惑しておりました。しかし、20-25ulはペレット量の10-20倍よりは少ないSDS量ではあると思うので、SDS量を増やしたプロトコールに変更してみます。 >>Boston Thank you for your reply! I will increase the volume of SDS buffer with sonication at first. If it does not work, I will try your method.

(無題) 削除/引用 No.816-5 - 2009/07/07 (火) 00:42:27 - Boston Here is my protocol for 2D-PAGE. Mitochondria fraction > + PBS > Sonication > TCA ppt > Acetone wash > + sample buffer Good luck!

(無題) 削除/引用 No.816-4 - 2009/07/06 (月) 23:30:49 - AP もちろん、「ミトコンドリアから核を除け」といっているのではなく、ミトコンドリアをペレットにして細胞質と分けたというなら、細胞核はどの程度除けているか、ということでしょう。そのあたりどうなんでしょうか。核もミトコンドリアも密度が高く沈殿しやすい画分ですから、核が確実に取り除けていなければ、ミトコンドリアと一緒に沈殿してくると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.816-3 - 2009/07/06 (月) 22:44:52 - み >[Re:2] 経験者さんは書きました : > 脱核しては？ > > ゼリーの原因はdnaでしょう。 脱核って・・・。 ミトコンドリアから蛋白を調製されているとのことですね。 まあDNAがネチョっとさせてる元凶でしょうが。 20マイクロリットルで抽出とは、ミトコンがどれくらい辺りなのか分からないので良くわかりませんが、pelletの10-20volのbufferで抽出されるべきでしょう（SDS bufferだと抽出効率良いのでメチャ濃い蛋白濃度になるでしょうから）。 このくらいのvolumeでsonicationかければ上手くいくのではと想像します。

(無題) 削除/引用 No.816-2 - 2009/07/06 (月) 20:43:56 - 経験者 脱核しては？ ゼリーの原因はdnaでしょう。

蛋白抽出時にゼリー状になってしまう 削除/引用 No.816-1 - 2009/07/06 (月) 17:46:14 - 小児科医師（ゆとり教育） いつもお世話になっております。 接着細胞を回収し、細胞質分画およびミトコンドリア分画の蛋白を抽出し、ウェスタンブロットをする実験を行っています。まず細胞膜を壊して細胞質分画を抽出し、ミトコンドリアのペレットに対してLaemmli bufferにて溶解しています。 しかし、ミトコンドリアのペレットに対してLaemmli bufferを加えると溶液がゼリー状になってしまいます。サンプルによって、ゼリー状になるものとならないものがあります。加えるLaemmli bufferの量は20ulで、ゼリー状になってしまったサンプルには、さらにLaemmli bufferを5ul追加してみたのですがやはりゼリー状のままです。 どのようにすればこのゼリー状になる現象を解決できるでしょうか？超音波破砕は試してみましたが、ミトコンドリア膜？などが壊れるせいか泳動する時にきれいなバンドになりませんでした。

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