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(無題) 削除/引用 No.809-21 - 2009/07/09 (木) 22:43:49 - masa いろいろご指摘ありがとうございます。 ＞Jacksonでbovine anti-goatとか普通に売っていますが。bovine由来なのでbovine IgGやBSAは基本的に認識しないはずです。Cy5標識のものがあるので、それで問題ないかと思いますが、いかがですか。 たしかにこちらを選択するべきでした。つぎに抗体を選ぶ際は必ずこれにしてみようと思います。 ところで、問題の２次抗体もＪａｃｋｓｏｎの物ですが、先日試しにいろいろやってみました。 そのまま使った場合、吸着した場合、使用前にＦＣＳと１：１でまず反応させた後に使用した場合、アイソタイプコントロール。 まず、そのまま使った場合の問題点としてはやはりバックグラウンドが非常に高いことです。 通常のdetector ampだと細胞全体が10の２乗ぐらいまで上がってしまい、positiveとnegativeの境界線がひきずらくなる。しかし、おそらくpositiveだろう細胞群はさらに強く光っている。 吸着した物、ＦＣＳと最初に反応させた物は通常のdetector ampで細胞群が全体的に低くなりますが、コントロールが１０の１乗以下に来てPositive群は１０の２乗から３乗に来てDot plot的にはいい感じに見えました。 吸着した物、ＦＣＳと最初に反応させた物のpositive群の％は５〜１０％ほどoriginalの抗体より減りました。 吸着した物、ＦＣＳと最初に反応させた物などを使ったやり方って有りですか？ 皆様どう思われますか？

(無題) 削除/引用 No.809-20 - 2009/07/07 (火) 12:10:00 - よっしー 先ほどはちゃんと読まずに書き込みました． 申し訳ありませんでした．(もう削除しました) masaさんの推測では，細胞のFcRにFCS中のbovine IgGが結合し， それに2次抗体が"クロスリアクト"していると言う考えですよね． 今までの経験ではあまりそんなことが起こったことないのですが・・・ どちらかと言うと１次抗体のノンスペの方が怪しいように感じるのですが． 1次抗体なしでも同じくらいバックグラウンドが上がるのですね．

(無題) 削除/引用 No.809-17 - 2009/07/07 (火) 11:23:32 - AP >私が持っている物だけでなく一般的にgoatの２次抗体はbovineとのクロスリンクがあるのでしょうか？（エピトープが似ているもしくは同じ？）そのため、もし吸着を行った場合goatへの活性も失ってしまう可能性はあるのでしょうか？ 、、、、いや、だからクロスリンクはまずいですって。 ヤギだろうとウシだろうと、種を越えてIgGは保存されていますから、共通のエピトープに対する抗体も出来ます。吸収によってそういう抗体種を除いて、種特異的なものを残しているのが市販の抗IgG抗体です。ちなみに、あなたの使用しているものの説明書にはどのように書いてありますか？たいていは、マウス、ラット、ヒト、ウサギ、ヤギ、ヒツジなど一次抗体によく使われそうな、あるいは適用する検体になりそうななかで異種のもので、一通り吸収してあるはずですが、ウシでも吸収済みでしょうか？ 吸収によってまれに特定のサブタイプに対する抗IgG抗体が失われてしまって、検出できなくなる場合があるようですが、一次抗体もポリクロのようですし、第一、先に述べたように市販の抗IgG抗体は普通、最初から吸収済みですから、吸収によって問題が起こることはまずないと考えて良いのではないでしょうか。

http:// 削除/引用 No.809-16 - 2009/07/07 (火) 03:10:14 - TK-1 Jacksonでbovine anti-goatとか普通に売っていますが。bovine由来なのでbovine IgGやBSAは基本的に認識しないはずです。Cy5標識のものがあるので、それで問題ないかと思いますが、いかがですか。

(無題) 削除/引用 No.809-15 - 2009/07/07 (火) 01:28:18 - masa いろいろ誤解があったかもしれませんが、確かにＦＣＳをつかわないでサンプルを作ればいいのと思います。ただ、現在のサンプルのストックがある程度ｎをそろえた状態でキープされていて、もう一度一からサンプルを取り直すには時間とお金がさらにかかるのでできれば別の方法で回避できないかと思っています。また、問題の２次抗体ですがクロスリンクするのはbovine IgGとＴＤＳに明記されていますがＢＳＡやdry milkも避けるようにとも書いてあります。 また、私が持っている物だけでなく一般的にgoatの２次抗体はbovineとのクロスリンクがあるのでしょうか？（エピトープが似ているもしくは同じ？）そのため、もし吸着を行った場合goatへの活性も失ってしまう可能性はあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.809-14 - 2009/07/06 (月) 23:36:10 - AP >FACSまでの処理をFCSからBSAにかえたら良いって言うだけですけど。 OK そういうことでしたか。トピの流れで、私以外にも誤読する人がいるかもしれなかったので、ポイントがはっきりしてよかったです。 >ここの操作はFCSじゃなければならない訳ではないのでしょう。 そうなんですか。やっていない人間の弱みでそういうところはわかりませんでした。私はまた、プライマリーカルチャーかなにかのためのサプリメントとしていれているのかとばかり思って、、、

(無題) 削除/引用 No.809-13 - 2009/07/06 (月) 20:11:31 - こうじ 反応するのがBovine IgGなんですよね。 FACSまでの処理をFCSからBSAにかえたら良いって言うだけですけど。 Ｆａｃｓでincubationさせるとき２％ＦＣＳをいれていたこと、また細胞のストックにＦＣＳ＋ＤＭＳＯを使っていることでバックが上がっていると考えられました。 ここの操作はFCSじゃなければならない訳ではないのでしょう。

(無題) 削除/引用 No.809-12 - 2009/07/06 (月) 12:31:04 - AP >FBSのかわりにBSAをつかっては？ えっ、何に？ 吸収処理のことでしたら、不適当と言わざるを得ません。BSAは血清アルブミンの特定のフラクション（Fraction V）が精製されたものですので、Igやほかの血清成分に対する吸収は望めません。

(無題) 削除/引用 No.809-11 - 2009/07/06 (月) 11:07:43 - こうじ FBSのかわりにBSAをつかっては？ 一番簡単だと思いますが

(無題) 削除/引用 No.809-10 - 2009/07/06 (月) 09:38:27 - AP 血清やIgGで前吸収したことはないんですが、組織や菌などのホモジネート/ライセートで良くやるようにアセトンパウダーにしてやれば良いと思います。 メーカー品でも血清で吸収処理しているものが多いようですから、FCSに10倍量くらいの冷アセトンを加えて沈殿を回収、乾燥させた粉末を二次抗体の希釈液に適当量入れてしばら反応して、遠心上清を使うという感じでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.809-9 - 2009/07/06 (月) 07:26:42 - masa たびたびすいません。 ＞ポリクロの場合は問題にある可能性のある種のIgGで吸収して交差を抑えています 具体的な手順を教えていただけますでしょうか？ 宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.809-8 - 2009/07/06 (月) 07:03:53 - masa いろいろご意見ありがとうございます。 動物は、ratを使ってます。 あと一次抗体はポリクロです。 やはり対応策としては、ラベリングがよさそうでですか？ 簡単、安い、おすすめのキットはございますか？

(無題) 削除/引用 No.809-7 - 2009/07/05 (日) 19:11:03 - いやいや >いけまっせ。 いえいえラベル自体は何だって行きますよ。 ただ今回はポリクロなのでその後の精製など踏まえ回答したほうがよろしいのではと申し上げたまでです。

(無題) 削除/引用 No.809-6 - 2009/07/05 (日) 18:03:27 - ami >> 一次抗体を蛍光で直接標識orビオチン化 > これは難しいと思いますけどね。 > おそらく一次抗体はポリクロですし。 いけまっせ。

(無題) 削除/引用 No.809-5 - 2009/07/05 (日) 15:43:12 - AP 「ふぇーくす」は全く経験がないので、ばりばりやっている人からみたらなんじゃそれと言われるかもしれませんが、 二次抗体をFBSあるいはBovine Igで吸収して使えばいいのではないでしょうか。特定生物種のIgGで免疫した二次抗体でも、どうしても別種のそれと交差反応（cross-react, cross-linkじゃ意味が違いますね）するものが出来てしまいます。モノクロなら交差しないクローンを選べば良いんですが、ポリクロの場合は問題にある可能性のある種のIgGで吸収して交差を抑えています（市販品の二次抗体のカタログに吸収処理をかけた種のリストが挙がっているのが普通ですね）。

(無題) 削除/引用 No.809-4 - 2009/07/05 (日) 14:33:11 - いやいや >一次抗体を蛍光で直接標識orビオチン化 連投すみません。 もしモノクロならそれでOKだと思いますね。 ただ蛍光標識だとネガコンが取れないので、ビオチン化を好んで使用しています。

(無題) 削除/引用 No.809-3 - 2009/07/05 (日) 14:31:24 - いやいや >一次抗体を蛍光で直接標識orビオチン化 >これにつきます。キットあります。簡単です。 これは難しいと思いますけどね。 おそらく一次抗体はポリクロですし。 masaさん >骨髄単核球分画 種は何ですか？ というかFACSでポリクロとはなかなか大胆だと思いますが。 ネガコンがしっかり取れてればいいですけどね。

(無題) 削除/引用 No.809-2 - 2009/07/05 (日) 13:52:01 - ami 一次抗体を蛍光で直接標識orビオチン化 これにつきます。キットあります。簡単です。

FACSにおけるバックグラウンドについて。 削除/引用 No.809-1 - 2009/07/05 (日) 12:24:57 - masa 現在、骨髄単核球分画を用いた、ＦＡＣＳを行っています。 １次抗体はGoatで２次抗体はDonkey anti-Goat IgG APC (Fab抗体） を使ってやっています。ブロッキングは、Donkey血清を使ってやっています。 しかし、バックグラウンドが非常に高く、よく調べたところ２次抗体にBovine IgGとクロスリンクすることが判明しました。 Ｆａｃｓでincubationさせるとき２％ＦＣＳをいれていたこと、また細胞のストックにＦＣＳ＋ＤＭＳＯを使っていることでバックが上がっていると考えられました。 なるべくなら、Goat-APCの組合せは変えたくないので他の抗体を探していますが、Bovineとのクロスリンクがないことが保証されたＡＰＣラベル抗体が見つかりません。どなたかご存じの方いらっしゃいますか？ また、別の方法として、FcレセプターについたBovine IgGをラベルされてないDonkey Anti-Bovineでふさいでしまうとバックは減るのでしょうか？それともエピトープが違う可能性があるでしょうか？ あと、Fc レセプターブロッカーの導入で防げるでしょうか？（細胞保存の時点で一回くっついたBovine IgGははずれるのでしょうか？） ご教示いただけると助かります。

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