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抗体カラムですか。それ。 削除/引用 No.782-4 - 2009/07/02 (木) 19:03:32 - C pH2.5まで下げて溶出ということでちょっと気になったのですがカラム精製というのはもしかして抗体カラムですか。もしも仮にそうだとすると、抗体を共有結合させていても、100%結合していないので溶出画分にははずれた抗体がどうしても少しコンタミしてくるので、蛋白質染色では見えないくらいでもウェスタンするとバシッとシグナルでるのでもしかしてそれ見てるとかいう事はないかなと思ったのですが。25K, 50K 75K 100K以上のあたりは怪しいです。 あと黄色いままでは電気泳動してもうまく行かないと思います。pH8くらいの濃いトリスを色が青くなるまで1μとかほんの少しずつ入れていってpHを中性付近までもっていって（pHは正確には合わせられないし、またそこまでする必要もないです。とりあえず青くなればいいです。）にしてからアプライします。

(無題) 削除/引用 No.782-3 - 2009/07/01 (水) 23:30:31 - AP pHが低い→[H+]が高い→タンパク質にチャージを与えているSDSのネガティブチャージ（SO4-)を中和する→タンパク質の移動度が低下する というストーリーでは？

(無題) 削除/引用 No.782-2 - 2009/07/01 (水) 23:09:51 - yt > また、気になった点なのですが、精製における溶出条件がグリシン-HCl >(pH2.5)なので、サンプルバッファーを加えますと黄色（通常青色）になる >のですが、これは問題なのでしょうか？中和させてから、泳動サンプルを作 >るべきでしょうか？ Yes, this would be a big problem and I think this explains all. I recommend you to neutralize the sample first. It is no surprise that BPB in the sample buffer turns yellow at low pH.

ウエスタンのバンド 削除/引用 No.782-1 - 2009/07/01 (水) 22:34:28 - さと ある抗原を動物細胞でタンパク発現させ、それをカラム精製しています。 精製画分に関して、ウエスタンブロッティングを行い、Elution画分に出てきているか等の確認を行っている中で、予想より遥かに高分子側にバンドがくっきり出てきてしまいました。 アプライしたサンプルは、目的サイズの位置にバンドが確認できるのですが、pHを下げて溶出させた画分は、高次構造のまま移動してないのではないか？というくらい、高分子にバンドが見えます。 これは、目的のものなのか、ノンスペなのか、どちらでしょうか？ ちなみに、１次抗体はマウスで作製したモノクローナル抗体を利用し、SDS-PAGEにおけるサンプルは、還元条件ですとバンドが出てきませんので、非還元条件で行っています。 また、気になった点なのですが、精製における溶出条件がグリシン-HCl(pH2.5)なので、サンプルバッファーを加えますと黄色（通常青色）になるのですが、これは問題なのでしょうか？中和させてから、泳動サンプルを作るべきでしょうか？ 何かアドバイスいただけますと、嬉しいです。 宜しくお願い致します。

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