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(無題) 削除/引用 No.776-6 - 2009/07/05 (日) 12:10:02 - masa 皆様　ご意見ありがとうございました。 当面は、westernしかやる予定がないのでTRIZOLで採れた物を使用しようと思ってます。 堅いペレットについてですが、原因の一つとしてゲノムのコンタミもあるかもしれません。 結局、再抽出下のですが、エタチンでゲノムが少し沈殿してました。 また、洗浄の際に低回転のホモジネーターを使ってやったところ、きれいにほぐれその後のペレットは、ピペットにてほぐすことができました。 乾燥後も解けやすかったです。（乾かしすぎるとまた解けにくくなります。） 皆様ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.776-5 - 2009/07/02 (木) 06:32:31 - おお 私もよくRNA抽出用キット(TRIZOLをふくめ)を使った時、発現チェックとしてタンパクを 同時に抽出します。確かにアセトンなどで沈殿させたタンパクは解けにくいです。 私は飽和ウレアを加えて、グラスビーズを加えボルテックスで無理やり砕いてます。さらに 2xPBSを加えまたボルテックスしています。 ウレアは確かにタンパクの修飾が懸念されていますが、たいてい検出ができています。 この辺は何をしたいかとかで、確かめるか考えるかする方がいいかもしれません。 アドバイスとしては強力なかようか剤と若干の塩濃度(多少塩が存在する方が 溶けやすい場合がある)を考慮してあとは物理的に拡散させより効率よく 溶解させるということでしょうか、、、

Trizolを用いた蛋白抽出 削除/引用 No.776-4 - 2009/07/01 (水) 22:39:46 - ペットはねこ たまにTrizolで蛋白を抽出します（RNA抽出時、ついでに）。 1)*アセトン（もしくはイソプロパノール）を入れてすぐに転倒混和する *多少のロス覚悟で弱めに遠心する(1000rpm, 30秒くらい） 　この二つをうまく使うと、そもそも堅いペレットになりません。 2)確かに、堅いペレットはどう頑張ってもなかなか溶けてくれません。1)の方法でできた「ゆるい」沈殿は6M尿素を含む液できれいに溶けます。いきなりSDSでは溶けにくかった印象があります。 3)可能かもしれませんが、そこで敢えてもう一度Trizolを使う理由はあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.776-3 - 2009/07/01 (水) 11:14:56 - 通りすがり いま手元に文献がないので引用元を示せないのですが、培養細胞からTrizolでタンパク質を抽出し、そのペレットを超音波破砕により分散･溶解させてリン酸化状態を調べる研究がありますので、リン酸化そのものは観測可能だとおもいます。 また超音波破砕によるペレットの分散は洗浄の際にも有効だと思います。 Trizolは第一選択ではないとのコメントには同意します。 強力な変性剤でリン酸化・脱リン酸化を抑えたいときに候補のひとつになるのかなぁと思っています。

(無題) 削除/引用 No.776-2 - 2009/07/01 (水) 03:56:46 - ピペド タンパク抽出の際に第一選択としてTrizolを使う人はまずいないとお考え下さい。ただウエスタンなどには問題なく使えます。リン酸化などは見れるかどうかわかりません。 �@少なくともRNA、DNAは除去できていると思います。 �A界面活性剤、熱いずれも有効ではなく、ペレットミキサーでしか溶かせられませんでした。 �B原理的には可能だと思います。

Trizolで蛋白抽出について。 削除/引用 No.776-1 - 2009/07/01 (水) 02:02:52 - masa Trizolで蛋白を取ってきてWesternをしようと思ってます。 �@抽出の際に、洗浄を何回かやりますが、その際のペレットが異常に堅くなかなかほぐれません。これでも洗浄できているのでしょうか？ �Aこのペレットを溶かす際も非常に堅く５０℃で溶かしてもほとんど解けません。ヘモジナイザーを使うと解けますがこんなんでいいんでしょうか？ �B一度ＳＤＳに溶かしてしまいましたが、ＳＤＳの量が多かったせいか蛋白濃度が薄くなってしまいwesternに使いにくくなってしまいました。再度Trizolで精製は可能でしょうか？ どなたかご存じでしたら御教示いただければと思います。 よろしくお願いします。

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