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(無題) 削除/引用 No.770-13 - 2009/06/30 (火) 17:25:21 - 通り 他の研究室とか、先生の知り合いとかに実際聞く。 これが最良。ビギナーであるのならなおさら。

(無題) 削除/引用 No.770-12 - 2009/06/30 (火) 16:44:04 - flower ありがとうございます。塩化リチウムはまだ開封していない新品のものです。 この６月から研究室に配属されたばかりで、右も左もわからずやっている感じです。もう少し勉強します。。。。

(無題) 削除/引用 No.770-11 - 2009/06/30 (火) 16:37:03 - Pumpkin 乾燥機器で乾熱かけられるものはないんですか？280度Cで2-3時間焼けばフラスコやビーカーのRNaseを除去できます（プラスチック製品は溶けるのでやめましょう）。 奥の手として使っているのはAmbionのRNase Zapです。これを吹きかけてDEPC処理水で濯いで、乾燥させて使います。おまじない程度というヒトもいますが、これで問題になったことはありませんね。Agilentのbioanalyzerなんかにも採用されていますので、実績としてはあるのだと思います。 （やりすぎって話もあるかもしれないのでこの辺で。。。）

(無題) 削除/引用 No.770-10 - 2009/06/30 (火) 16:32:17 - Pumpkin LiClは分子生物学用ということで、RNase Freeだと思いますが、試薬メーカーのカタログを見るなりして確認してください。ただ、分子生物学グレードだからなんでも大丈夫というわけではありません。（新品なら大丈夫ですが）その試薬がどのように扱われてきたかとかも重要でしょう。 DEPCはご存じですか？DEPC処理はウォータバスとオートクレーブがあればできます。その位はした方がいいと思います。オートクレーブも極少量のRNaseであれば効果はあるのですが、結構入ってしまうと除去しきれません。２回というのもどのように決められたか知りませんが、個人的な満足に過ぎないでしょう。 メスシリンダーなんかをオートクレーブにかけるのも個人的には、違和感を覚えます。計量器ですよ。 >研究室で遺伝子をやっているのが私だけ あせらずにじっくり構えて実験をされたほうがいいと思います。とはいえ、一回やってみて分解されなければそれでいいのかもしれませんが、臨むスタンスはちゃんと考えた方がいいと思います。

Pumpkin様 削除/引用 No.770-9 - 2009/06/30 (火) 16:21:44 - flower ありがとうございます。 研究室で遺伝子をやっているのが私だけの為、分子生物学実験に必要な基本的な設備は皆無状態なんです、、 なので、今回はdH2Oを２回オートクレーブしたもの用いるつもりです（まだ作っていません。。）。フラスコやメスシリンダーなどの器具類も２回オートクレーブしてます。 肝心の塩化リチウムは分子生物学用と記載のあるものです。これらで作った場合、、まともなデータは取れないでしょうか？？というか、、分解されてしまいますか？

(無題) 削除/引用 No.770-8 - 2009/06/30 (火) 15:26:13 - Pumpkin flower 様 RNase Free WaterかDEPC処理水、またはDEPCを使って調製されるんですよね？DDWに溶解して、オートクレーブだけですか？そもそも試薬はRNase freeですか？試薬特級ならまぁ、大丈夫だと思いますが、開けてから数年たっているものとかだとちょっと心配です。 ちょっと老婆心ながら心配になってます。結構、大丈夫なときは大丈夫ですが、だめなときはがっつり分解されますよ。大事なサンプルなら（どうでもいいサンプルはあまりないと思いますが）、ひとつひとつ慎重にどうぞ。

どうもありがとうございます 削除/引用 No.770-7 - 2009/06/30 (火) 15:05:28 - flower Pumpkin様、AP様丁寧なアドバイスをありがとうございます。 大変勉強になります。とりあえず、今回は作った後、オートクレーブにかけて使用することにしました。 どうもありがとうございました。

どうもありがとうございます 削除/引用 No.770-6 - 2009/06/30 (火) 15:02:26 - flower

(無題) 削除/引用 No.770-5 - 2009/06/30 (火) 14:25:42 - Pumpkin >なんぼLiClにRNaseの変性作用があるといっても AP様のおっしゃる通りです。説明が不足していたように思います。

(無題) 削除/引用 No.770-4 - 2009/06/30 (火) 11:43:40 - AP たしかに、オートクレーブをしないで調製するというのも一つの見識ですね。実は、私も試薬を計って溶かすだけていどの調製なら、50-mLのディスポコニカルチューブにでも試薬をぶっ込んで、滅菌純水（必要に応じてDEPC処理水）を入れて溶かして、そのままストックとして使います。体積あわせはチューブの目盛りを使います。メスリシンダーの方が幾分は正確かもしれませんが、些細な誤差の範囲です。オートクレーブによって蒸発、吸湿、あるいは吹きこぼれなどが起こるほうがよっぽど濃度が不正確です。 ただ、ちょっと気になったのは、なんぼLiClにRNaseの変性作用があるといっても、尿素やグアニジンと同じように、unfoldingによるものでしょうから、不可逆というわけではないでしょう。RNA精製の初期段階では、不活性化の後に除タンパク質をしてRNaseを除くのでいいですが、除タンパク質後のアルコール沈殿で加えるLiClにRNaseがコンタミしていた場合、RNAと完全に分離することはなく、溶解後にrenatureする可能性もありますね。 このトピを読んで、RNase不活性化作用があるのだからそんなに神経質になる必要はないんだ、と思って油断する人がいるといけないので、念のため。

(無題) 削除/引用 No.770-3 - 2009/06/30 (火) 10:24:15 - Pumpkin 私個人としては、オートクレーブを用いないように、溶液を作製します。そもそも塩化リチウムにはRNaseを阻害する作用があるのですが、分子生物学グレードのLiClとNuclease Free Waterを用いて、RNaseを失活させるために乾熱やDEPC処理したガラス器具などを用いて調製すればオートクレーブの必要はありません。そもそもオートクレーブではRNaseは失活できず、もっぱらDNA Nucleaseの失活の意味で行われていると思います。不必要なオートクレーブは、オートクレーブ缶内の蒸気による汚染が起こり得ますので推奨しません。 LiClは溶かすだけで良いですが、結構発熱しますのでゆっくり溶解させた方がいいと思います。モル計算はご自分でご確認ください。

(無題) 削除/引用 No.770-2 - 2009/06/30 (火) 10:18:44 - AP オートクレーブokです。DEPC処理も可能です。RNase-freeの水、器具などが用意できない場合はDEPC処理をおすすめします。

RNA抽出用　塩化リチウムの作り方 削除/引用 No.770-1 - 2009/06/30 (火) 08:49:39 - flower 初めて行うRNA抽出キットではイソプロパノールを使うところで塩化リチウムを使います。 今まで塩化リチウムを作った経験がなく、どうしようかと思っているのですが、ネットで探しても作り方がなかなか見つかりません。 計算はなんとかできたのですが、（50mlの４Mをつくるので、分子量42.4として50mlに8.48gの塩化リチウムを溶かすのでいいんですよね？？） で、これをオートクレーブするかどうかがわからなくて、困っています。 一緒に使う３M酢酸ナトリウムは調製後にオートクレーブするようなので、塩化リチウムもするのかどうか悩んでいますが、、。 まだまだビギナーなんですが、、御存じの方がいらしたら教えてください。

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