全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.761-12 - 2009/07/01 (水) 14:22:02 - MI 皆様ご教授ありがとうございます。 上にでたバンドがユビキチン化された蛋白Aなのか 免沈してユビキチン抗体で見てみます。 それらしい様でしたらcycloheximideも検討します。 どうもお騒がせしました。

(無題) 削除/引用 No.761-11 - 2009/07/01 (水) 06:37:08 - 使用経験乏しいですが、、、 加えて、CHXと併用すると分かり易くなるかも知れませんね。 （結構みかける気がします。この手の実験で） でも新たなWBで、より高分子量の領域でバンドが増えているとの事ですし、Cさんが仰るようにIP-Ubの抗体でWBという方法（またはCさんが提示したその他の方法）でいけそうですね。

(無題) 削除/引用 No.761-10 - 2009/06/30 (火) 20:12:57 - C 蛋白質Aの抗体で免疫沈降したものを電気泳動して抗ユビキチン抗体でウェスタンしてみると蛋白質Aのユビキチン化体が分かります。もしも免疫沈降が困難ならば、His-tagかなにかを付けた蛋白質Aを細胞に発現させてMG132処理して、タグをたよりに蛋白質Aを取ってきて電気泳動して抗ユビキチン抗体でウェスタンすることで、あるていど分かります。逆にタグ付きユビキチンを発現させて、蛋白質Aでウェスタンでもいいです。いわゆるプルダウン実験というやつで、ユビキチンやユビキチン化蛋白質で修飾されているかどうかを簡単にしらべる目的で非常によく行われる方法なので論文も多いと思います。

(無題) 削除/引用 No.761-9 - 2009/06/30 (火) 19:41:48 - MI ご指南ありがとうございます。 >時間依存的にはどうなんでしょう？ 増えてから減るということもあるのですね。 細かいタイムコースはとっていませんが、 6,12,24時間まで入れっぱなしにすると、より減っているように見えました。 しかし時間とともに細胞が死んでいくので、 蛋白量が厳密にそろっているのか自信がありませんでした。 実はC様にご指摘いただいたようにゲルのトップまで見てみました。 スタッキングゲルには何もなかったです。 しかしゲル濃度を変えたからか、今まで気付かなかったのですが、 蛋白Aの30-40kDa上にコントロールより増えているバンドがありました。 これがユビキチン化された蛋白でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.761-8 - 2009/06/30 (火) 02:39:07 - 使用経験乏しいですが、、、 時間依存的にはどうなんでしょう？ 一回増えた後で減っているのか、常に減り続けているかで解釈に違いが有るでしょうし。 もちろんそれだけでは何もいえないでしょうが、ちょっと気になったもので。

(無題) 削除/引用 No.761-7 - 2009/06/29 (月) 23:35:02 - おお >[Re:6] MIさんは書きました : > おお様　ご返答ありがとうございます。 > > >例えばmRNAレベルは変わっているでしょうか? > mRNAは確認していませんでした。 > MG132により転写抑制因子などの蛋白が増える、ということでしょうか。 間接的な影響というなかにそう言うのも含まれているとお考えください。

(無題) 削除/引用 No.761-6 - 2009/06/29 (月) 20:59:29 - MI おお様　ご返答ありがとうございます。 >例えばmRNAレベルは変わっているでしょうか? mRNAは確認していませんでした。 MG132により転写抑制因子などの蛋白が増える、ということでしょうか。 >bortezomibとかはそのため比較的癌に特異的 Lactacystinなどと一緒に、他のプロテオソーム阻害剤も検討してみます。 aimar様 ご指摘ありがとうございます。 >溶媒の影響はありませんか？ MG132はDMSOに溶かしたものをMediumに1000倍希釈で使用しています。 コントロールはDMSOのみです。 確かに濃度を上げた時のコントロールDMSOはとっていませんでした。 蛋白濃度は揃えたつもりでしたが、濃度を上げると細胞障害もありました。 dose dependentとは言えないかもしれませんね。 それでも、同量のDMSOのコントロールに比して蛋白Aは明らかに減っていました。

(無題) 削除/引用 No.761-5 - 2009/06/29 (月) 19:14:24 - aimar 溶媒の影響はありませんか？ 確かMG132は水に溶けなかったと思います。 dose dependentに影響が出ているとのことなので、DMSOやエタノールが影響しているってことはありませんか？ コントロール実験ではどのようになるでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.761-4 - 2009/06/29 (月) 13:52:56 - おお 間接的影響もあるかもしれません。例えばmRNAレベルは変わっているでしょうか? それと詳しくないのですが、基質によってプロテアソームで処理されるプロテアーゼが異なり、特定の阻害剤である基質には効いたり、ほかには効かなかったりというのがあるそうです。bortezomibとかはそのため比較的癌に特異的 だと説明されているようです。

(無題) 削除/引用 No.761-3 - 2009/06/29 (月) 13:17:07 - MI C様ありがとうございます。 ポリユビキチン化して上の方に溜まることがあるんですね。 スタッキングゲルまで見ていませんでした。 確認してみます。 Lactacystinも教えていただきありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.761-2 - 2009/06/29 (月) 12:22:48 - C 高分子量の方やゲルのトップ、スタッキングゲルやウェルの下あたりには何か変化ありませんか。 ポリユビキチン化formとして蓄積しているのではないでしょうか。実際、プロテアソームを阻害したときは高分子量ポリユビキチン化体が著明に増加しますのでそういうものの中にあるのではないでしょうか。MG132に限らず阻害剤の標的は一つとは限らないし、いろいろな可能性があるし、濃度依存的に効いているようなので、技術的なミスでなくおそらくなにか意味のある現象とおもいます。これはこれで重要なオブザベーションなので、こうなるはずなのに、と決めつけないで大事にした方がいいと思います。MG132よりもよりプロテアソームへの特異性の高いラクタシスチンも試してみた方が良いと思います。

MG132で蛋白が減る 削除/引用 No.761-1 - 2009/06/29 (月) 12:05:00 - MI MG132で理解に苦しんでいます。 HEK293T細胞をMG132,ALLNにてそれぞれ処理し、 Western Blottingにて内因性蛋白Aを非処理と比較しました。 蛋白Aと結合するE3ligaseも報告されており、 よくユビキチン化される蛋白だと聞いていました。 なのでMG132処理によって蛋白量は増えるだろうと考えていましたが、 dose-dependentに著しく減っていたのです。 ALLNでは非処理とあまり変化ありませんでした。 MG132の作用条件が悪かったのかとも考えましたが、 別の内因性蛋白BはMG132処理サンプルで増えていました。 またbeta-actinの蛋白量は揃っています。 MG132で蛋白量が減っているように見えるのは、 どのような理由が考えられるのでしょうか？ どなたかご教授お願いいたします。

全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---