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Western Blotting の結果について トピック削除
No.758-TOPIC - 2009/06/29 (月) 10:38:22 - to
いつも勉強させて頂いております。

Western Blotting の結果について、質問させて頂きたいことがございます。
よろしくお願いします。

サンプル：
ある一種類の接着細胞(マウス)を、培地とプレートの組み合わせを変えて培養したもの。合計８種類。
Whole cellを Lysis Buffer によって、溶解。

抗体：β-actin

結果ですが、８サンプル中、６サンプルは、目的バンドを４５kDa付近に検出できました。バンドの濃さは揃っておりました。

しかし、残りサンプル中、１サンプルでは４５kDa付近にバンドがまったくみられず、かわりに３０kDaおよび２０kDa以下に、別のはっきりとしたバンドが検出されました。
もう１サンプルでは、うっすらと４５kDa付近にバンドが見られるものの、
２０kDa以下のバンドの方が、よりはっきりとしたバンド検出となっております。

Western Blotting初心者であり、この結果をどのように解釈してよいのかわからず、困っております。

どなたか、この件につきご存知であれば、ご教授のほどよろしくお願い申し上げます。
　
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(無題) 削除/引用
No.758-7 - 2009/07/01 (水) 21:18:50 - A
今のところ特にアドバイスできそうな考えはないのですが検出に使った
抗体はデータの感じからしてポリクロですか？

(無題) 削除/引用
No.758-6 - 2009/06/30 (火) 09:05:17 - to
おお 様

ありがとうございます。
サンプル量には、今後も気をつけて実験を行いたいと思います。

(無題) 削除/引用
No.758-5 - 2009/06/29 (月) 23:33:19 - おお
>[Re:4] toさんは書きました :

> おお 様
> サンプルは、７ug分、流しております。
> ５ug分でも、と思ったのですが、β-actinではなく、発現量を確認したい、別の本来の目的のバンドが非常に薄いので、７ug分にしてみたのですが・・・多いでしょうか。

いい感じだと思います。量は問題ないです。

(無題) 削除/引用
No.758-4 - 2009/06/29 (月) 16:34:36 - to
ご返答、ありがとうございます。

C 様
ブロッキング濃度や抗体濃度を変更して３回行ってみたのですが、全て同様の結果となってしまいました。

プロテアーゼインヒビターカクテルですが、Lysis Buffer を使う直前にいれてはおりましたが、培養条件によっては、阻害しきれないプロテアーゼ活性も出てくるのでしょうか。
Lysis Buffer を加えた後の、各操作を特に素早く、他のサンプルよりも４℃での静置時間短くする、などで防げたりするでしょうか。
SDS−SampleBufferでの溶解も試してみたいと思います。ありがとうございます。

おお 様
サンプルは、７ug分、流しております。
５ug分でも、と思ったのですが、β-actinではなく、発現量を確認したい、別の本来の目的のバンドが非常に薄いので、７ug分にしてみたのですが・・・多いでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.758-3 - 2009/06/29 (月) 13:55:27 - おお
今私のラボの学生は、のせ過ぎでバンドが現れないという
ミスをしています。
のせた量はどのくらいでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.758-2 - 2009/06/29 (月) 12:44:01 - C
全て同じサンプルで一部にそういう事が起きていればなにか技術的な問題とかんがえられますが、それぞれ培地やプレートの条件が違うサンプルでパタンに差異がみられたということなので、それはそれでそういう事なのではないでしょうか。とりあえず新たなプレパレーションで再実験して再現性があれば、結果を受け入れて先に進んでよいのではないかとおもいます。たしかアポトーシスなどのときにアクチンの分解が起きるというのを昔どこかで見ました。（不確かなので必要ならば確認してください）

それと、ある培地でばいようするとある種のプロテアーゼ活性が高まるとか、アクチンなどのプロテアーゼ感受性が高まるとかもありえるのではないでしょうか。ただこのプロテアーゼを考える時いつもつきまとう難しい問題は、いつ分解されたということで、細胞内ですでに分解がおきているのか、細胞をlysisするとき起きたことなのかということです。細胞内でアクチンの分解が亢進していれば細胞形態にも変化が現れる事が予想されますので、もし細胞の形態には差異がみられないならば後者の可能性も十分考慮する必要があるでしょう。これに関連して、ある培養条件だとある種のプロテアーゼ活性が高まっていてゆえにlysis時に起こる（通常はほとんど目立たないような）蛋白質分解が強く見られたとかいう可能性もあるでしょう。lysis時にはプロテアーゼインヒビターカクテルを使うとか、後の実験に支障ないならばSDS-sample buffer（bMEとBPBはまだ入れない）で直接細胞を溶かしてみたらどうでしょう。

Western Blotting の結果について 削除/引用
No.758-1 - 2009/06/29 (月) 10:38:22 - to
いつも勉強させて頂いております。

Western Blotting の結果について、質問させて頂きたいことがございます。
よろしくお願いします。

サンプル：
ある一種類の接着細胞(マウス)を、培地とプレートの組み合わせを変えて培養したもの。合計８種類。
Whole cellを Lysis Buffer によって、溶解。

抗体：β-actin

結果ですが、８サンプル中、６サンプルは、目的バンドを４５kDa付近に検出できました。バンドの濃さは揃っておりました。

しかし、残りサンプル中、１サンプルでは４５kDa付近にバンドがまったくみられず、かわりに３０kDaおよび２０kDa以下に、別のはっきりとしたバンドが検出されました。
もう１サンプルでは、うっすらと４５kDa付近にバンドが見られるものの、
２０kDa以下のバンドの方が、よりはっきりとしたバンド検出となっております。

Western Blotting初心者であり、この結果をどのように解釈してよいのかわからず、困っております。

どなたか、この件につきご存知であれば、ご教授のほどよろしくお願い申し上げます。
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