200であろうが300kDaであろうがセミドライでやっているものです。
確かに、ウエットより融通が効かないので難しい面があると思います。
融通がきかないと言うのは既に指摘がありますように、
バッファーが少量なのでトランスファーする時間にかなり
制限があるというところでしょうか。90分が上限です。
ゲルの濃度も考慮に入れないといけないと思います。
これも時間に融通がきかないのでウエットより慎重に考慮しないといけません。
均一なゲルならものがなるべくしたから1/3のエリアに来るのが
セミドライでは理想ですが大きなタンパクなら上から1/3流れれば
トランスファーでほぼ問題がなく移っているように思えます。
200kDaなら6%位8%でも何とかなるかもしれませんね。
グラジエントは経験がほとんどないので分かりません。
T/Cは考慮に値すると思います。
あとゲルの厚さも重要ですね。
次にバッファーです。私は個人的にはTowbin Bufferより
pHが高い物を進めます。塩基性のポジティブな電荷をつぶす
ためです。バイオラッドのセミドライシステムの
マニュアルやミリポアの解説に各種バッファーが載っています
ので参考になるかと思います。
加えてメタノールの量です。通常20%が使われますが高分子側では
トランスファー中にメタノールが拡散して固定されてしまう
可能性がありますので私は5%まで落とすことがあります。
ニトロセルロース膜では最低5%は必要です。
PVDFはもしかしたらなしで行けるかもしれませんが、やったことが
ありませんのでわかりません。
裏技として、電気へいどうそうのバッファーのSDSを0.1より下げる
というのもあります。0.03%まではだいじょうぶでした。
そうすると過剰なSDSを膜にさらさなくて良いので、PVDF、メタノールなし
のトランスファーで有利かと思いますし、メタノールを加えるにしても
低い濃度でいいと思います。 |
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