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(無題) 削除/引用 No.750-7 - 2009/06/29 (月) 17:52:56 - ゲノム UpStream様 言葉足らずで申し訳ありませんでした。 Cycle Sequenceのことです。 ＞ということで、結果をいつ出せるか即答できない状態であり、かつ私がご要望を忘れないと期待しつつ、気長にお待ちいただければと思います（だめだったとして、テクニカルな問題点を論じられるような結果を得られるとは思えないので、「できた」か「できなかった」かだけしか答えられないような気もしますが）。 覚えていらっしゃいましたらよろしくお願いします。

わかりました 削除/引用 No.750-6 - 2009/06/29 (月) 17:23:27 - UpStream ゲノム様 >当方もゲノムからPCRをしたら上流配列が手に入るのではないか ご要望を頂いておきながら、失礼ですがPCRベースで配列を得ることは一般的な方法です。最近の他のトピにありますようにゲノムウォーキングが汎用される方法かと思います。と、いじわるな回答をしておいてCycle Sequenceのことをおっしゃっているのですよね？実は、遺伝子の上流配列をとることは決まっているのですが、「どの」遺伝子にするかは決めておらず、方法（キット等を含めて）をどうするかを思案しているところです。これに関してはシークエンスしてみろということになっておりますので、決まっておりますが、どの遺伝子にするかはもうちょっと考察が必要な時点であるのです。 ということで、結果をいつ出せるか即答できない状態であり、かつ私がご要望を忘れないと期待しつつ、気長にお待ちいただければと思います（だめだったとして、テクニカルな問題点を論じられるような結果を得られるとは思えないので、「できた」か「できなかった」かだけしか答えられないような気もしますが）。

(無題) 削除/引用 No.750-5 - 2009/06/29 (月) 15:28:59 - ゲノム UpStream様 解決済みのところ、申し訳ありません。 当方もゲノムからPCRをしたら上流配列が手に入るのではないかと密かに考えていましたが、これまで実行するには至っておりませんでした。 もしご迷惑でなければどのような結果になったか教えていただけると幸いです。

ありがとうございました。 削除/引用 No.750-4 - 2009/06/27 (土) 21:02:38 - UpStream AP様 このようなトピにレスをつけて頂いて、ありがとうございます。また、一日を無駄にさせるような内容とは思わず、ご迷惑をおかけしております。 私がお聞きしたかったのは、未知領域を単離する方法として、ゲノムショットガンなどのようなゲノム解析の手法以外においてダイレクトシークエンスというストラテジーが皆様の間でどれだけ行われているのかという疑問点です。 BACやファージライブラリーなどの比較的大きいテンプレートに対するダイレクトシークエンスが日常的に行われていることは存じております。ただ、真核生物のゲノムにおいて（数十Mbですが）、このような方法を取られる方がいるのでしょうか。25bp程度のプライマーであれば特異性は計算的には十分ですが、アニールの温度などやその他条件によって非特異的な伸長がかなり懸念されるような気もしているのです。 しかし、まずは、やってみればよいことでもあるのでゲノムを出来る限り綺麗に抽出してシークエンスに望んでみたいと思います。だめであれば、そのゲノムを使ってクローニングを進めればよいと思いますので。 ボスとはしっかりとディスカッションできる環境ですので大丈夫かと思います。ご助言ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.750-3 - 2009/06/26 (金) 22:32:11 - AP >ダイレクトシークエンスが難しいからではないかと思ってしまいます（コピー数の問題以外にも）。 こりゃあ、悩む前にまずやってみろ、というケースでしょう。うまくいくにしてもいかないにしても一日あれば結果がでます。うまくいかなかったら、データを持ってボスに報告に行けば、上流域を単離してからの方がいいんでないかいということになるかもしれません。ああ、うだうだ考えているだけで一日無駄にした、、、、 実際やってみて、簡単にはうまくいかなそうな結果がでても、自分の考えに固執して、いいからいった方法でできるまでやれ、というアレなボスなら問題ですが、もしそうなったらまた相談にきたらいいと思います。

上流配列の取得について 削除/引用 No.750-1 - 2009/06/26 (金) 18:35:24 - UpStream いつも勉強させていただいています。 ゲノム配列が決定されていない真核生物種を扱っており、今回遺伝子Aのプロモーター配列を入手することになりました。私は、クローニングして塩基配列を決定することしか考えていませんでした（cDNAの既知配列、制限酵素、アダプタ、PCRを用いて上流断片を単離）。この案に対して、上司はcDNA既知配列からのダイレクトシーケンスをするように指示を受けました。 そこで、ご質問なのですが、ゲノムのダイレクトシーケンスというのは一般的なのでしょうか？BigDyeなどの説明書をみると鋳型をゲノムに使用する場合には1-3ug使うといったように取扱いはあります。しかしながら、未だゲノムウォーキングやRACEの方が盛ん（見当違いだったらすみません）なのは、ダイレクトシークエンスが難しいからではないかと思ってしまいます（コピー数の問題以外にも）。

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