全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.747-16 - 2009/06/30 (火) 23:03:02 - ビオ >AP様 たくさんのアドバイスありがとうございました。 皆様から頂いた情報をもとに自分で実験をして確認してみます。 また何かありましたら宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.747-15 - 2009/06/28 (日) 21:32:15 - AP ダウンストリームでどういう実験を行おうとしているのか、何を目的としてどういう実験をしようとしているのか、が示されていないので（何かかなり特殊なことを狙っているようにも見えます）、これが適用できるかどうか自信がないのですが、 >逆転写する際にdNTPやバッファーの濃度を調節することによって、逆転写開始点から逆転写される長さを調節する技術はあるでしょうか？ ランダムプライマーであれば、プライマーの量（鋳型対プライマーの比率）を振ることで、プローブ断片の平均長をコントロールすることは可能です。 >皆様の話を考慮すると、cDNAを分解するのは難しそうなので、逆転写時に長さを調節できないかと思いました。 いや、決して難しいことではなく、ただ実用的なレベルでDNAのアルカリ水解はできないだろうということだけです。長時間（30分とか）のboil（沸騰水浴）で断片化するというプロトコールもあるくらいですから（自分でやってみるとそれではぜんぜんだめだったので、depurination + boilを採用していますが）、適切なやり方であれば難しいということではないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.747-14 - 2009/06/28 (日) 14:11:29 - ビオ >AP様 アドバイスありがとうございます。RNase Hは既に使用しているのですが、濃度をもう一度見直しています。 AP様のランダムプライマーで逆転写するという話がありましたが、逆転写する際にdNTPやバッファーの濃度を調節することによって、逆転写開始点から逆転写される長さを調節する技術はあるでしょうか？皆様の話を考慮すると、cDNAを分解するのは難しそうなので、逆転写時に長さを調節できないかと思いました。

(無題) 削除/引用 No.747-13 - 2009/06/27 (土) 11:07:14 - AP >ところで、マグネシウムやマンガンのような金属イオンを加えて９５℃で加熱するとRNAを断片化できるという話を聞いたことがあるのですが、これはDNAにも適用できる方法なのでしょうか？ 過去トピで、RNAサンプルに残存するDNAを分解するためのRNase-free DNase Iで処理に関連して触れられていたと思います。DNase Iを効果的に働かせるのにはMgよりもMnのほうがよさそうだとか、Caを加えると活性が相乗的に高くなるなんて話があって、でも処理後にDNase Iを熱失活させる場合、二価カチオン存在下で加熱すると、RNAが分解するという話のことでしょう。文献も挙がっていたと思います。DNAは、まあ分解しないでしょうね（分解するなら、各種酵素処理の後、熱失活という手は使えないはず）。 >RNaseを熱処理というのも良いですね。早速試してみます。 自分で粉から調製する場合は、そうするのが普通の方法です。 調製済みの溶液なら、すでにそういう処理がしてあります。高級品ならカラム精製とか高度な精製を施してDNaseを除いているかもしれませんが、通常の目的では必要以上にコストをかけることになるでしょう。 また念のためですが、RNase Aは二重鎖を分解しないので鋳型RNAとcDNAは解離させておく必要があるでしょう。あるいは二重鎖を分解するRNase Hなどの処理を加えるか。

(無題) 削除/引用 No.747-11 - 2009/06/27 (土) 01:23:20 - ビオ >あかね様 ソニケーションは試してみたかったのですが、機械が無いためできないのです。RNase+EDTAなら理論的にはDNAを分解することはなさそうですね。 >AP様 RNaseを熱処理というのも良いですね。早速試してみます。 ところで、マグネシウムやマンガンのような金属イオンを加えて９５℃で加熱するとRNAを断片化できるという話を聞いたことがあるのですが、これはDNAにも適用できる方法なのでしょうか？ 記憶が曖昧なうえに切断できる原理が不明なため見当違いのことを言っているかもしれませんが、もし本当なら魅力的に思っています。何かご存知でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.747-10 - 2009/06/26 (金) 22:04:44 - AP >というよりも、どうやってRNAではなくてcDNAのみが存在していると証明したら良いか悩んでいます。RNase処理をして泳動し、残ったバンドが cDNAであると言おうかと思いましたが、RNaseはDNAも切断することがあると聞いたので、完璧な証明にはなり得ないと思いました。 一般的にはクルードのRNase A粉末を熱処理でDNase-freeにしたhome-madeのRNase Aを使うことが多いですが、それでも、少なくとも通常レベルのRNase処理で、DNAが分解されることはありませんので、杞憂です。 出来上がったビオチン化cDNAの品質チェック（完全長伸びているか）や、断片化の評価は、電気泳動してメンブレンにブロットして、標識アビジンで検出すればよろしい（独創的なアイデアというのでは全くなくて、正攻法だと思いますが）。

ソニケーション 削除/引用 No.747-9 - 2009/06/26 (金) 21:41:02 - あかね ビオさん、 お困りのようですね。私ならDNAプローブを短くするのに、アルカリ加水分解は”絶対”使いません。 私なら、ソニケーションしてDNAを切断します。通常のソニケーターでDNAをソニケーションするとだいたい500~ 200 bpくらいまで短くなります。ソニケーションをやり過ぎてもこれ以上短くなることは経験的にないです。これは一本差DNAの場合も同じです。ウォーターバスタイブのソニケーターにcDNAの入ったチューブをいれて、ソニケーションします。 それとcDNAが合成されているかどうかはRNaseでいいでしょう。もちろんDNase freeのRNaseを使って。RNaseがDNAを分解するというトピックもあるようですが、DNase活性があったとしても、 ビオさんの実験には全く影響がないくらいの低い活性だと思います。RNaseを信用していいと思います。どうしても心配ならRNaseの反応溶液にEDTAを加えてはどうですか？ それか一回cDNAをクローニングした方が早いかも？

(無題) 削除/引用 No.747-8 - 2009/06/26 (金) 20:41:36 - ビオ >AP様 変成ゲルで電気泳動はしています。また、事情によりランダムプライマーで逆転写はできないので、どうしても分解する必要があります。 アルカリで加水分解したつもりのDNAの泳動レーンに見られるスメアがDNAのフラグメントによって生じたのか、鋳型mRNAやrRNAなどが加水分解されたのかについては、確認はしていません。というよりも、どうやってRNAではなくてcDNAのみが存在していると証明したら良いか悩んでいます。RNase処理をして泳動し、残ったバンドがcDNAであると言おうかと思いましたが、RNaseはDNAも切断することがあると聞いたので、完璧な証明にはなり得ないと思いました。 avidinで標識した蛍光色素をゲルにふりかけて、cDNA中のbiotinと結合させようかと考えています。何か良い案をご存知でしょうか？ また、アルカリでDNAを加水分解するとしたら、A,T,G,C,Uの塩基のうち、加水分解されやすい塩基間やされにくい塩基間というのはあるでしょうか？ 質問ばかりですが、宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.747-7 - 2009/06/26 (金) 02:56:53 - AP 考えたら、この場合、加水分解なんて面倒なことしなくてもランダムプライマーで逆転写したら断片化したcDNAになりますね（遺伝子特異的プライマーみたいな特殊なプライミングが必要な実験デザインでなければ）。

(無題) 削除/引用 No.747-6 - 2009/06/26 (金) 02:42:30 - AP >身近な人たちがアルカリでDNAは切断できると言っていたことや、DNAがアルカリで加水分解されないとなると先人の実験結果を否定してしまうことになるため、自分は信じたくないのです。 そうなるともうサイエンスの話じゃあないですな。別にロシュさんがとんでもなことをいっているわけではなく、公知の化学的性質であって、生化学、分子生物学の教科書、あちこちで読めることなんですけれど。 なんだか、実験系自体が心配になってきたなあ。どういう泳動をして加水分解が起こっているか判断してるのだろうか。念のため言いますが、一本鎖DNAなので、そのままではサンプルごと、分子ごとにいろいろな二次構造をとるので、変性ゲルでなければサイズはでませんし、比較もできませんよ。未処理のコントロールは、どこまでside-by-sideにしているのでしょうか。鋳型RNAの分解はしているのでしょうか。特に鋳型RNAの分解ステップを設けていないなら、アルカリ処理したものでは鋳型RNAが分解して一本鎖DNAが生じ、未処理のコントロールではRNA:DNAの二重鎖のままという可能性もありますが、そのへんは問題ないでしょうか。 塩基にビオチンがくっついているわけですが、直接くっついているわけではありません。くっつけるための腕として、あるいは立体障害を回避するため、リンカーあるいはスペーサーと呼ばれる、主に炭素からなる、かなり長い骨格が入っています。これがアルカリにさらされると切れてくるんですね。ロシュのDIGではアルカリで切れやすいバージョンと、耐性のあるバージョンを出していますが、耐性のあるほうでも強アルカリだとだいぶ標識が落ちるみたいです（アルカリトランスファのサザンで、DIG標識マーカーを使った場合と、見標識のマーカーをDIGプローブでハイブリして検出した場合では、あきらかに後者の方がシグナルが強い。前者はマーカーとしてならまあ使えるという程度）。 なので、通常ならDNAを断片化するにはHClでdepurinationしたのち、NaOHでグリコシド結合の骨格を切るところですが、DIG DNAプローブを断片するとき、私はNaOHの代わりにbiolしています。

(無題) 削除/引用 No.747-5 - 2009/06/26 (金) 01:30:14 - ビオ お二人ともご回答ありがとうございます。 確かにDNAはRNAと違って2'のヒドロキシル基がないためにアルカリに強いことは知っています。ttp://roche-biochem.jp/faq/23_469_ja.html のような情報もあるのですが、身近な人たちがアルカリでDNAは切断できると言っていたことや、DNAがアルカリで加水分解されないとなると先人の実験結果を否定してしまうことになるため、自分は信じたくないのです。 >AP様 アルカリで加水分解されてしまうリンカーとは具体的にどのような物でしょうか？ご存知でしたら教えてください。

(無題) 削除/引用 No.747-3 - 2009/06/26 (金) 01:16:35 - おお レスどうしようかと思ってたのですが、、、、、 アルカリ加水分解は通常RNA分解のためにやるんですよね、、、 それでDNAが切れているという判断なら、条件とか系を見直した ほうがいいとおもいます。 指摘がありますように ビオチンの取り込みのため分子量が大きくなるので移動どは 遅くなるというのが一般的な解釈だとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.747-2 - 2009/06/26 (金) 00:54:03 - AP ビオチンがつくと移動度が変わるので、非修飾とサイズが違うのは道理だと思いますが。 RNAならともかくDNAがアルカリで加水分解しますかね。そうとうシビアな条件が必要だと思いますが。塩酸でdepurinateしたあとなら別ですが。 それと、アルカリ処理のあとビオチンはちゃんと残っていますか？リンカーの構造によってはアルカリで切れてしまうものもあります。

ビオチン修飾DNAについて 削除/引用 No.747-1 - 2009/06/26 (金) 00:29:15 - ビオ こんにちは。 逆転写時にビオチン修飾したdNTPを取り込ませて、ビオチン修飾cDNAを合成しています。これを適当な長さにアルカリ処理で加水分解し、プローブに使いたいと考えています。 ここで本題ですが、ビオチン修飾したcDNAは非修飾のcDNAに比べて加水分解されづらくなるというようなことはあるでしょうか？ 誤差の範囲かもしれませんが、加水分解後の電気泳動後のバンドサイズがビオチン修飾cDNAと非修飾cDNAで違っているので、ビオチンによって安定化しているのかと考えています。 ご回答宜しくお願いします。

全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---