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(無題) 削除/引用 No.746-12 - 2009/07/06 (月) 14:01:51 - TQ TT様 里親へは５匹を目途に預けています。 実子がICRだと、成長も早く、大きいので、2-3匹に減らしています。 減らしすぎると、保温しずらいですし。 ES株に関しては、 以前はTT2、今はB6由来の自前ESや、Balb由来の自前ESです。 複数ライン樹立した中から、キメラ作製成績が良いものを用いています。 インジェクションで産仔が得られるか、 アグリゲーションで産仔が得られるかは、 試してみないことには、なんとも・・・。 （片方しか試してないケースも良くありますので）

(無題) 削除/引用 No.746-11 - 2009/07/02 (木) 12:46:50 - Taku TT2 でした。

(無題) 削除/引用 No.746-10 - 2009/07/02 (木) 01:31:12 - TT Taku様、TQ様 ところで、アグリゲーションされていたES細胞はTT2でしたでしょうか？ といいますのも、現在何故か高率キメラが生まれてきませんのでESを変えることも検討しているのですが、TT2は販売されていません。 129とC57のハイブリッドであるv6.5は販売されているようなのですが、このESは個人的に使用経験があり、ほぼ100%近くgermline transmissionが起こっていましたので、できれば使用したいと考えています。 ただし、このESはmicroinjectionでキメラにしていましたので、アグリゲーションでも使用可能かどうかが気になっています。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.746-9 - 2009/06/30 (火) 13:19:48 - TT TQ様ありがとうございます。 今アグリゲーションしているクローンは、7匹生まれた全てがほぼ黒目だったのですが、全てが目開きでした。うち2匹は脱腸を起こしていました。 里親に育てさせてはみたのですが、全滅でした。里親にうまく育てさせるコツのようなものはありますでしょうか？ ちょっと思ったのは、里親の実子が数匹のなかに弱っている目開きマウスを入れると、乳首の取り合いに負けてしまってる気がしたのですが。実子はかなり少なくした方がいいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.746-7 - 2009/06/30 (火) 10:01:13 - TQ 眼が開いていたり、脱腸だったりすることは よくあります。 脱腸だと蘇生しませんが・・・。 ES寄与率が高いと、多い傾向があるようです。 何が原因かはわかりません・・・。

(無題) 削除/引用 No.746-6 - 2009/06/29 (月) 18:36:25 - TT Taku様、TQ様、ありがとうございます。 ところで、ESのクローンによってはいつも帝王切開時に目があいて生まれてきて、しばらくすると弱って死んでしまうことがあるのですが、これは帝王切開がまずいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.746-5 - 2009/06/29 (月) 09:34:02 - TQ １.　10-20くらい ２.　ほとんどが胚盤胞に 　　（ただし、主に8-cellで行ってます。翌日に胚盤胞で移植） 　　事前に、培地のロットチェック（発生確認）は必ずしてます。 ３.　ES細胞はゼラチンコートディッシュでFeeder除いてから用いてます。 　　ばらばらになった細胞を20-30個くらいでしょうか。 　　数が多いときには、ふりかける数を変えたりします。 ４.　キメラ産仔は、0-10匹/20-24移植、平均６匹くらいでしょうか。 　　普通の移植だと7-8割は生まれるんですけどねぇ。 ↓このプロトコルが近い感じです。 NagyLab http://www.mshri.on.ca/nagy/diploid/diploid.htm

(無題) 削除/引用 No.746-4 - 2009/06/28 (日) 16:34:46 - Taku > ほとんどが胚盤胞になるとのことですが、ESをふりかけるとこの割合はESのクローンによっては低くなったりするものでしょうか？ 特にそんな印象はありません。 > また、これらの胚盤胞を移植したうち、何割くらいが出生に至るものでしょうか？私の手では大体1-2割くらいしか生まれてないようなのですが・・・。 胚盤胞は両方の子宮に１２個ずつ、一匹のメスに合計２４個移植して、少ないときで２〜３匹、多いときで１０匹程度の仔が生まれていました。 > 最後に、採卵する時のメディウムは、M2 mediumを使ってましたでしょうか？ M2 を使っていました。

(無題) 削除/引用 No.746-3 - 2009/06/28 (日) 12:11:16 - TT Taku様ありがとうございます。 ほとんどが胚盤胞になるとのことですが、ESをふりかけるとこの割合はESのクローンによっては低くなったりするものでしょうか？ また、これらの胚盤胞を移植したうち、何割くらいが出生に至るものでしょうか？私の手では大体1-2割くらいしか生まれてないようなのですが・・・。 最後に、採卵する時のメディウムは、M2 mediumを使ってましたでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.746-2 - 2009/06/26 (金) 10:31:46 - Taku 昔やっていたので、覚えている範囲で。 １．採卵は４週齢ICRから行っていました。平均10〜15個／匹くらいでした。 ２．確かにほとんどは胚盤胞になっていたと思います。割合が低かったという経験がないので、注意すべき点についてはよく分かりません。 ３．ESは、完全にバラバラにした後に、ゼラチンコートしたディッシュでしばらく置いてフィーダーを接着させ、10^6 cells/mlの懸濁液にしてその中に morula を放り込んでいました。ここは色々なやり方がありますが、特にどれが標準というわけでもなく、それぞれのラボでうまく行った方法を採用しているという事だと思います。 ともかく、まず何もしていないES細胞を使ってキメラ率や germline transmission を自分の手で確認しておかないと、思わない回り道をすることになります。

アグリゲーションでキメラを作成している方いますか？ 削除/引用 No.746-1 - 2009/06/26 (金) 00:15:21 - TT 別のトピックでもお世話になっています。 今回は、アグリゲーションについて質問させてください。 現ラボでは、アグリゲーションを用いてキメラを作成しているのですが、標準的な結果と異なっているような気がしてきましたので、経験者の方のアドバイスをいただければと思います。 1. 採卵を7週齢のICRから行っているのですが、1匹から平均10個ほど採取しています。これは標準的な個数でしょうか？平均30個ほどと書いてある文献もありますが、少ないのではないでしょうか？また、採卵週齢も4週齢あたりで行っている文献も多く、その点も疑問です。 2. 採卵したmorulaのうち、ESをふりかけなくても、胚盤胞を形成するのは40%程度です。文献によっては90%以上が胚盤胞になると記載されているものもあり、標準よりも低いのではないかと心配しています。何か注意すべき点があるでしょうか？ 3. ESは完全にばらばらにしてから20個程度ふりかけていますが、feederも入ってしまっていると思います。文献によっては、ESをトリプシン処理した後に緩くしかピペッティングせず、8-15個の塊を作ってふりかけるとしているものが散見されるのですが、こちらの方が一般的なのでしょうか？ microinjectionの方が一般的だとは思うのですが、経験者の方、どうぞよろしくお願いいたします。

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