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(無題) 削除/引用 No.744-4 - 2009/06/25 (木) 23:08:24 - mokumoku APさん　ご助言ありがとうございました。 ライブラリーを作成した制限酵素は6塩基配列認識で4塩基認識はまだ試していなかったので、今度試してみようと思います。 また、PCRを用いた手法で上手くいかなければ、やはりファージライブラリーからの取得を考えた方が良いのでしょうか。ファージライブラリーから目的クローンを釣ってくる作業には時間がかかるイメージがありましたが、頑張ればそれほど時間がかからなそうですね。急がば回れ。こちらの手法も考えてみようと思います。 どうもありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.744-3 - 2009/06/25 (木) 22:31:23 - AP ゲノムを切断する酵素はどんなのを試したんでしょうか。ひょっとすると近位にサイトがないために、非常に長い距離のPCRが走らなければ取得できないのかもしれません。1 kbくらいの短い範囲なら4塩基認識の酵素を使えば、PCRベースでもいくかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.744-2 - 2009/06/25 (木) 22:25:15 - AP PCRベースでてこずるようなら、原点に戻ってラムダファージベクターでゲノムライブラリーを作り（生物種によっては市販品もあり）、プラークハイブリでスクリーニングして取得した方が早いんじゃないでしょうか。1 kbくらいの範囲ならユニークな（反復配列を含まない）プローブさえ使えば、確実にとれます。月曜日から金曜日まで働けば、ゲノム精製、ライブラリー作成から初めて、スクリーニングで単一クローンを単離するのに十分です。

ゲノムウォーキングについて 削除/引用 No.744-1 - 2009/06/25 (木) 22:06:45 - mokumoku 現在ClontechのGenomeWalker™ Kitを用いて、目的遺伝子の上流プロモーター領域の取得を目指しています。しかし、得られる配列が非特異的な配列ばかりで、全くウォーキングが進まず困っています。 これまでに何種類もprimerを作成し直し、ライブラリーを作成する制限酵素をいろいろと換えたり、ゲノムを取り直したりして試してみましたが上手くいきません。 ちなみにInverce PCRも試してみたのですが、上手くいっておりません。 上流域500bp〜1kb程度の配列が欲しいので、それほど長い配列では無いと思うのですが、取得のために何か良い方法があれば教えて下さい。

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