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カルナバイオサイエンス 削除/引用 No.742-8 - 2009/08/26 (水) 07:52:43 - 老いぼれ猫 キナーゼ専門のカルナバイオサイエンス（株）に相談されては。

(無題) 削除/引用 No.742-7 - 2009/06/26 (金) 19:33:52 - kinase ご回答ありがとうございます。 > 共沈後hotなATPを加えて同じ残基がリン酸化されるなら、キナーゼが共沈されて来ている証拠の一つになりますよね。 仰るとおりです。大変参考になります。 > 共沈してくるようなキナーゼの場合には、基質はキナーゼの非触媒部位とアフィニティーがある場合が多いような印象があります。この印象が正しいとすれば難しいアプローチのような気がします。 私もこの点を危惧しておりました。caspase阻害ペプチドのように酵素をとらえて放さないように設計できたら売れますね。 > それらを使うことによって、少なくとも「関与するのが、どのキナーゼファミリーか？」ということがすぐわかる、ということです。 始めからネガティブ発想ありきでお話ししていたみたいで申し訳ありませんでした。特異性の緩い阻害薬を何種類か（順々に）用いて絞っていけるかも知れませんね。対象のアミノ酸はセリンです。もしご存知でしたらこの場合に（最初の選択として）適切な阻害薬がありましたらお教え願えませんか？

(無題) 削除/引用 No.742-6 - 2009/06/26 (金) 18:56:33 - ? 「考えられるkinase」というのは、基質の配列から予想したkinaseなのかと思いますが、 私が申し上げたかったのは、例えば、Srcファミリーの阻害剤とかで処理した場合 リン酸化されないのであれば、Srcファミリーが関与するとか、そういうことです。 リン酸化されるアミノ酸は、チロシン、セリン、スレオニンなのかわかりませんが、 それらをリン酸化するキナーゼの阻害剤は結構あります。 それらを使うことによって、少なくとも「関与するのが、どのキナーゼファミリーか？」ということがすぐわかる、ということです。 これを頼めないのだとすると他の実験はもっと手間と金がかかると経験上思います。 最初から釣り上げるという考えこそ、上の人に何の当ても無く言えることではないのでは？

(無題) 削除/引用 No.742-5 - 2009/06/25 (木) 20:00:55 - 中年 > リン酸化部位に変異を入れた場合と比較したりして何とか見つからないかと思っています。ただ、kinaseとその基質の結合はかなり安定か心配です。 一概には言えないと思いますが、共沈してくる例も多く報告されています。共沈後hotなATPを加えて同じ残基がリン酸化されるなら、キナーゼが共沈されて来ている証拠の一つになりますよね。 > また質問で申し訳ないのですが、proteaseの場合のように、（阻害）ペプチドで非可逆的に捕まえることはkinaseの場合でも出来ないでしょうか？ リン酸化部位の周辺配列を阻害ペプチドとして利用し、さらにそれを精製に用いるということでしょうか。私は聞いたことがありません。共沈してくるようなキナーゼの場合には、基質はキナーゼの非触媒部位とアフィニティーがある場合が多いような印象があります。この印象が正しいとすれば難しいアプローチのような気がします。

(無題) 削除/引用 No.742-4 - 2009/06/25 (木) 18:06:35 - kinase 早速のレスありがとうございます。 >リン酸化の程度が変動する培養条件を見つけてキナーゼの当たりを付ける。 通常の培養時にリン酸化されていますが、残念ながら（私どもが試した限りでは）大きくリン酸化状態が変化する条件を見出しておりません。 >共沈してくるタンパク質の中からキナーゼを探す。 これは視野に入れております。リン酸化部位に変異を入れた場合と比較したりして何とか見つからないかと思っています。ただ、kinaseとその基質の結合はかなり安定か心配です。また質問で申し訳ないのですが、proteaseの場合のように、（阻害）ペプチドで非可逆的に捕まえることはkinaseの場合でも出来ないでしょうか？ >ホモログが存在している下等なモデル生物の知見を参照する これは試してみます。何か分かるかも知れません。 >代表的な阻害剤を用いて実験してみるというのが最初のステップではないかと思いますが・・・。 記載の仕方が良くなくて申し訳ございません。考えられるkinaseに対する（そしてたまたま持っていた）阻害薬は使ってみましたが、否定的でした。現在の所理由を持って試すことが出来る阻害薬がない状態です。購入に際して上の者を説得できるほどの理由を付けたいところです。もう少し文献などを調べて試してみる価値のある阻害薬が考えつかないかと思っています。

(無題) 削除/引用 No.742-3 - 2009/06/25 (木) 17:26:58 - ? 何をもって「闇雲」とおっしゃっているのかわかりませんが、 代表的な阻害剤を用いて実験してみるというのが最初のステップではないかと思いますが・・・。 それによって、どのようなキナーゼかあたりをつけることが出来るからです。 ほかの難しい実験をやることこそ「闇雲」である気がします。

(無題) 削除/引用 No.742-2 - 2009/06/25 (木) 14:47:50 - 中年 リン酸化の程度が変動する培養条件を見つけてキナーゼの当たりを付ける。 共沈してくるタンパク質の中からキナーゼを探す。 ホモログが存在している下等なモデル生物の知見を参照する（共同研究も視野に含める）。 他に何かあるかなぁ･･･

protein kinaseの探索 削除/引用 No.742-1 - 2009/06/25 (木) 14:27:22 - kinase あるタンパク質の特定のアミノ酸残基がリン酸化されることが分かりました。 このサイトをリン酸化するkinaseを同定したいと思っています。 前後の配列から想定されるkinaseがあったのですが、そのkinaseの関与は否定されました。 kinaseに特化したsiRNAライブラリーを用いてみることも考えたのですが、高価でとても手が出ません。 闇雲に阻害薬を使いまくるのも良い手だと思えません。 皆様、この様な状況にあった場合どのような手段をお執りになりますか？

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