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神経細胞初代培養 トピック削除
No.740-TOPIC - 2009/06/24 (水) 22:29:38 - 初代初心者
いつも参考にさせていただいてます。

今回、とあるKOマウスの解析で、神経細胞の初代培養を行うことになりました。とりあえず、神経細胞の突起伸長などを解析したいと思ってます。

様々な論文を読んでいて、グリアを除去するためにAraCを使っている場合と、グリアを除去しない場合(論文にはグリアの除去とは明記なし)がありました。両者とも、似たような解析(形態解析)をしていました。

そこで、質問なのですが、グリアの存在下および非存在下での培養に決定的な違いはあるのでしょうか?

神経細胞のタイプによりグリア存在下でないと培養できない、またはその逆ということなのでしょうか?
 
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(無題) 削除/引用
No.740-7 - 2009/06/26 (金) 14:33:27 - 初代初心者
参考文献ありがとうございます。

とりあえず、トライしてみたいと思います。

マウスでの詳細な発現部位の特定もまだなので、、

(無題) 削除/引用
No.740-6 - 2009/06/25 (木) 16:07:22 - み
>[Re:5] 初代初心者さんは書きました :
>
> 今回は以下の4種類neuronで行いたいと思ってます。
> cortical neuron
> hippo
> mesencephalon
> cerebellum granule
>
> この中で、弱いneuronはあるでしょうか?
> み さんの中で、オススメの参考文献、教科書などあれば教えていただきたいです。


前者2細胞しか経験ありません。いずれもneurobasal+B27でいけるでしょう。hippoはE18,corticalはもう少し早めのE16あたりが一般的だったかなあ(これはちょっと曖昧)。一応E18からでもcorticalも取れますが調製しにくい。
どちらかというとhippoの方が突起観察に適したneuronが調製しやすいですかね。樹状突起上のspineなど興奮性neuronに特徴的な構造ができるでしょうし。hippoからだとinterneuronも混在するでしょうが。
corticalの方は細胞数は稼げるけど樹状突起やspineの発達がpoor。

優先順位はKO遺伝子の発現部位と見たい現象が何かでしょうね。

文献はBanker GAが本家?

B27supplement使うなら:
J Neurosci Methods. 2008 Jun 30;171(2):239-47.
NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.

J Neurosci Res. 1995 Dec;42(5):674-83.
Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.

J Neurosci Res. 1993 Aug 1;35(5):567-76.
Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.


他のsource(mesencephalon、cerebellum granule)は良く知らないです。

(無題) 削除/引用
No.740-5 - 2009/06/25 (木) 12:37:24 - 初代初心者
培地交換は半量交換というのは、文献読んでわかったのですが、使用するカバースリップによっても変化があるのは知りませんでした。

今回は以下の4種類neuronで行いたいと思ってます。
cortical neuron
hippo
mesencephalon
cerebellum granule

この中で、弱いneuronはあるでしょうか?
み さんの中で、オススメの参考文献、教科書などあれば教えていただきたいです。

(無題) 削除/引用
No.740-4 - 2009/06/25 (木) 10:18:08 - み
>[Re:3] 初代初心者さんは書きました :
> >3-4週間培養でタクマシイ樹状突起を伸ばさせるのは難しいですよ。
>
> これは、培地選択などの条件が難しいということで考えていいのですよね?

培地は短期培養も長期培養も変更しないですが(対象の細胞に適した培地で維持すれば良い)、neuronはnaiveなので頻繁にまたは長時間室温で顕微鏡観察したりして温度が変化すると弱ったりします。
medium changeも「足すだけ」または「一部吸って足す」という感じでやっていました。

細胞密度は濃い方が強い。

AraC処理も24hだけにしていました。一度増殖止めてやれば良いので。

使用するカバースリップ(カバーガラス)のメーカーやcoating法によっても突起のタクマシサが違う・・・。

今回のneuronの種類(source)が分からないのであれですが、細胞ばらすときの制限酵素処理のやり方・pipetting法などの加減がポイントになることもあります。

あまり頭でっかちになってもあれなので、一度経験して下さい。
上手い人に一度見せてもらうのが良いのですが。

(無題) 削除/引用
No.740-3 - 2009/06/25 (木) 09:44:13 - 初代初心者
み さん

ご回答ありがとうございます。

アストロは、そんなに増殖するんですね。勉強不足でした。。
神経細胞自律的な表現型を見るためなら、グリアマイナスで行ったほうがいいみたいですね。

>3-4週間培養でタクマシイ樹状突起を伸ばさせるのは難しいですよ。

これは、培地選択などの条件が難しいということで考えていいのですよね?

(無題) 削除/引用
No.740-2 - 2009/06/24 (水) 23:43:24 - み
決定的な違いという漠然とした感じで問われると答えるのに難しいですが。

AraCで増殖を止めておかないと、特にアストロがドンドン増殖してきて数週間長期培養する場合は見た目にも(染色して突起形態を見るなど)、神経細胞を対象とした目的の解析にも(例えばneuronに発現しているタンパク・遺伝子を扱っているのにアストロさんがウジャウジャ増えて細胞数で勝ってくると嫌でしょ)邪魔になってくる。
でもアストロが共存した方がgrowth factorなんかを出しているだろうしneuronにとっては元気な度合いが違ってくることもあるでしょう(僕は昔、ほんの少し混在させるために、AraCは培養3日目の時点で処理していました)。アストロさん達が増えすぎると培養液の栄養取られるのかneuronが弱ってくる。

本来の神経細胞初代培養法であるバンカー法(?間違ってたらすみません)は元々、グリアをfeederにしてその上にneuronかってたんじゃないですか?
最近はneurobasal medium+B27サプルメントでしたっけ?なんかが汎用されてfeeder法をわざわざやってる人は少なくなってるだろうけど。

培養初期での突起の発芽や伸長を見るだけなら薄まきにして突起に特異的な抗体で染色するだろうし、グリアさんはあまり気にならないのかもしれませんが。

sourceにする脳部位の違いによって、またはneuronの違いによって培養法は違ってくるので(mediumも違えば動物の年齢も違う)、コンタミしてくるneuron以外の細胞種・割合が違ってくるでしょう。

初心者が1人で立ち上げるとハマルかも・・・5日以内の可愛らしいneuronの観察ならセンス次第で何回かやればできるかもしれませんが、3-4週間培養でタクマシイ樹状突起を伸ばさせるのは難しいですよ。

神経細胞初代培養 削除/引用
No.740-1 - 2009/06/24 (水) 22:29:38 - 初代初心者
いつも参考にさせていただいてます。

今回、とあるKOマウスの解析で、神経細胞の初代培養を行うことになりました。とりあえず、神経細胞の突起伸長などを解析したいと思ってます。

様々な論文を読んでいて、グリアを除去するためにAraCを使っている場合と、グリアを除去しない場合(論文にはグリアの除去とは明記なし)がありました。両者とも、似たような解析(形態解析)をしていました。

そこで、質問なのですが、グリアの存在下および非存在下での培養に決定的な違いはあるのでしょうか?

神経細胞のタイプによりグリア存在下でないと培養できない、またはその逆ということなのでしょうか?

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