全13件 ( 1 〜 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.74-14 - 2009/03/13 (金) 21:06:52 - ちろ 基本的なことですが、100mM　GSH溶液は作り置きですか？感覚的にGSHは水溶液にしちゃうとへたりやすい印象があるので、溶出バッファーを作るときは、その都度50mM Tris-HClに目的の終濃度になるようにGSHを加えてpH合わせた方がよいような気がします。見当違いでしたらごめんなさい。 pH 8.0でより出づらくなるっていうのは考えづらいかも…。 それとだらだら出てるタンパク質って同一タンパク質なのは確かなんですよね？

(無題) 削除/引用 No.74-13 - 2009/03/13 (金) 16:20:07 - むらさき そのまま同じトピックで質問させて頂きます。 以前と同じ組成でpHを８に合わせ、溶出バッファーとして用いましたが 以前以上に後のフラクションまでダラダラ溶出されてしまいました。 今回はカラムを新しくしたので樹脂は新しいです。 グルタチオンの濃度を濃くするなどはこれから行おうと思っていますが、 pHを上げたことで、さらに悪化したように感じたため 何か問題点が上げられればと思い、さらに質問させて頂きました。 宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.74-12 - 2009/02/26 (木) 14:25:46 - むらさき ＞たいあさん ありがとうございます。 では、早速試してみたいと思います！

(無題) 削除/引用 No.74-11 - 2009/02/25 (水) 18:06:53 - たいあ Tris baseでもほとんど問題ないと思いますよ。実験上は。多少濃度がずれますが。

(無題) 削除/引用 No.74-10 - 2009/02/25 (水) 10:27:29 - むらさき ＞たいあさん ありがとうございます。 早速測定してみます。 。と思ったのですが、１つ疑問点があります。 100mM Tris-HCl 25mL 100mM グルタチオン 5mL DW 20mL で後濃度 50mM Tris-HCl 10mM グルタチオン を調整してからpHを測定して低いことが分かった場合 Trisを入れてpHを上げると、終濃度が変わってしまいますよね？ メスアップの前に測定したとしても、Trisで調整しても大丈夫なのでしょうか？ 根本的なところが抜けているようでしたら申し訳ないのですが どなたか教えていただければと思います。 宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.74-8 - 2009/02/25 (水) 09:34:02 - たいあ RHさんの書いているとおり、 グルタチオンをいれると結構、酸性によりますよ。 もちろんグルタチオンを入れた状態でpH8以上でないと きっちり落ちてこないと思います。 まずは、pHをチェックするのが最初だと思います。

(無題) 削除/引用 No.74-7 - 2009/02/25 (水) 09:27:55 - むらさき ありがとうございます。 ＞名無しさん なるほど。濃度を濃くしてですね！試してみます！！ ＞RHさん 先輩のプロトコル？によると、pH８のトリスと混ぜてあるのですが、 最終的な溶出バッファーの濃度がpH８以上じゃないとダメなのでしょうか！？ 一先ず、前回の溶出バッファーの濃度を測定してみます。

(無題) 削除/引用 No.74-6 - 2009/02/24 (火) 03:51:13 - RH Tris-HClの状態でpH 8.0に合わせているのでしょうか？ GSH（還元型グルタチオン）を加えるとpHは下がりますから、pH 8.0以下になっていませんか？ もともとのTris-HClのpHを高めに設定するか、GSHを混ぜたあとにTrisを加えてpHを8以上に戻す必要があると思います。

(無題) 削除/引用 No.74-5 - 2009/02/24 (火) 02:07:03 - 名無し グルタチオンが古くなり酸化されてきたのかもしれない。とりあえず一応溶出されるならば、グルタチオン濃度をいまの２倍くらいにして、溶出の際にベッドボリュームより少し少ないくらいの量の溶出bufferをゆっくりロードしたら、いったんカラムの出口を閉じて５分から10分程度そのままおく。それから出口をひらいてゆっくり溶出液をフラクショネーションする。ブロードにならずにある程度まとまって回収できるとおもう。

(無題) 削除/引用 No.74-4 - 2009/02/24 (火) 01:15:47 - むらさき ありがとうございます。 ＞たいあさん トリスのpHは氷にさした状態でpH８に合わせたものを用いています。 ＞りょうさん 私の溶出バッファーに変えるまでは、 ちゃんとelu３、４で溶出されているので、 塩の問題では無く私のバッファーの問題だと思うのですが･･･ 樹脂は、今回は初めて再利用しました。 特級EtOH⇒70％EtOHで流した後、 70％EtOHを満たした状態で保存していたものを 70％EtOH⇒PBSで洗いました。 PBSは100mL以上流しています。 溶出時間は以前に比べて倍以上かかりましたが、 吸着させた濃度も以前より濃いからだと思っていたのですが･･･ 何か他に原因がありそうでしょうか？ 質問ばかりで申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.74-3 - 2009/02/23 (月) 20:32:30 - りょう 塩も生理的濃度で入れておいた方が良いのでは。 不溶化してダラダラ溶出されてるとか。 あと樹脂はフレッシュですか？

(無題) 削除/引用 No.74-2 - 2009/02/23 (月) 19:55:39 - たいあ ｐHが大事です。

GST融合タンパクの溶出バッファーに関して 削除/引用 No.74-1 - 2009/02/23 (月) 19:18:01 - むらさき 現在、GST融合タンパクをカラムで精製する際に 以下の組成の還元型グルタチオン溶出バッファーを用いています。 終濃度 50mM Tris-HCl 10mM GST 以前は、先輩のバッファーで溶出していましたが、 無くなったため、自分で作って溶出しました。 すると、目的のタンパク質が、綺麗に分画されなくなってしまいました。 具体的には、elu１〜８のうち 以前はelu３、４で殆ど溶出されていたものが、 殆ど全ての画分で溶出されます。 溶出バッファーに問題があると思うのですが、 何か作製時に注意すべき点がありましたら教えていただきたいです。 私の作製した組成は、 100mM Tris-HCl 25mL 100mM GST 5mL DW 20mL です。トリスは以前から先輩が用いている物を利用しました。 また、グルタチオンは常温になった後、計量し100mMを作製しました。 宜しくお願い致します。

全13件 ( 1 〜 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---