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(無題) 削除/引用 No.734-9 - 2009/06/29 (月) 19:03:12 - ぷ 急速凍結されておられたのですか？大抵の細胞ですと、iPSや大腸菌とは違って、保存液が、という前に、凍らせる速さのコントロールは真っ先に考える必要があります。一度程度下げるのに一分くらいかけられるような、専用の凍結装置も売られてますし、また、ー８０℃に入れると、それくらいの速さで温度が低下するというふれこみで売られている容器もあります。しかし、うちで試してみると、専用容器よりも、バイヤルを小さな紙箱を入れてプチプチでくるんで、試薬を保存するときなどに使う小さめの発泡スチロールの箱に入れてー８０℃に置くというもっともチープなやり方が、viabilityが断然高くなりました。その後で、液体窒素や-150度に入れてます。この凍らせ方で生存率が全く違います。もちろん解凍は急速に行う必要があります。保存液にお金を使うよりも、DMSO添加でほとんどの場合は問題ないので、この速さをいろいろと変えて試して見られることをお奨めします。

段階的な凍結 削除/引用 No.734-8 - 2009/06/29 (月) 18:03:10 - a いきなり-153℃での凍結は細胞へのダメージが大きいと思います。 まっくろんさんがご指摘のように、段階的に凍結(-20→-80→-153℃）させてみてはいかがでしょうか。またDMSOを使った凍結は死滅しやすいので慎重なハンドリングが必要です。 駄目なら市販の細胞凍結液を使ってみるのも１つの手です。 色々と販売されているようですが、十慈フィールド社の「セルバンカー」がお奨めです。 また、凍結する際の細胞密度が薄すぎるということはありませんか？

(無題) 削除/引用 No.734-7 - 2009/06/24 (水) 14:34:43 - 中年 それで、凍結の操作は？

(無題) 削除/引用 No.734-6 - 2009/06/24 (水) 14:28:36 - きゃ > 5〜10％ＤＭＳＯの入った凍結阻止剤入りの『(10~)20%』血清入りＤＭＥＭ培地ですよね？ はい。5〜10％DMSO、血清入りのＤＭＥＭ培地です。

(無題) 削除/引用 No.734-5 - 2009/06/24 (水) 14:25:29 - まっくろん 　皆さんご指摘のように、血清は入れるべきかと（書き忘れかもしれませんが）。私の場合は、10%FBS/DMEMに10%になるようにDMSOを入れ、徐々に凍結しています（-20C → -80C → 液体窒素）。また、凍結細胞保存液（セルバンカー）などでは細胞を起こす際にある程度ピペッティングしても平気でしたが、10%DMSO（10%FBS/DMEM）の場合は、慎重にしないと（ほぼピペッティングしないくらい）、起こすのが難しかった経験があります。 　参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.734-4 - 2009/06/24 (水) 12:34:47 - ＊ 細かな事ですが、 >5〜10％ＤＭＳＯの入った凍結阻止剤入りのＤＭＥＭ培地 5〜10％ＤＭＳＯの入った凍結阻止剤入りの『(10~)20%』血清入りＤＭＥＭ培地ですよね？ 血清が入っていないと、細胞損傷が大きく、極めて起きてきにくいです。

(無題) 削除/引用 No.734-3 - 2009/06/24 (水) 11:00:55 - Pumpkin あなたの培養している細胞のデータシートには、保存法におけるなんらかの留意事項はありましたか？保存補助剤や保存方法は適切でしたか？あなたの研究室で初めて扱う細胞なら分譲先に訊ねるべきですし、研究室でストックしているものであれば保存される実験ノートや先輩に訊くのが最も良いでしょう。 一般的な事項として、「緩慢凍結急速解凍」（保存方法や起こし方）がバイアビリティに影響しますし、保存補助剤も同様です。

(無題) 削除/引用 No.734-2 - 2009/06/24 (水) 10:57:42 - 中年 凍結の操作は具体的にはどのように行いましたか？ また、私は専用の凍結用溶液を用いるようになる前は、10% DMSOを入れた血清そのもので凍結していました。

凍結用培地について（細胞培養） 削除/引用 No.734-1 - 2009/06/24 (水) 10:35:18 - きゃ ご教授して頂けたら大変ありがたいです。初歩的な質問で申し訳ありません。お願いします。 上皮（腺癌細胞）の細胞培養を行い、細胞を凍結保存する際に5〜10％ＤＭＳＯの入った凍結阻止剤入りのＤＭＥＭ培地を使用し、−１５３℃のフリーザーで凍結させたのですが、再びその細胞を解凍し培養を始めると、細胞が上手く育ちません。また、細胞質に空胞があり、フラスコへの接着もほとんどありません。おそらく細胞がなんらかの影響で死んでいると思われます… なぜでしょうか??

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