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トピ主です。 削除/引用 No.733-14 - 2009/06/25 (木) 03:28:05 - 分生初心者 皆様、ご回答ありがとうございました。 コンストラクトの構築に関しましては新たにN末端にメリチン由来のシグナル配列（通りがかり様のおっしゃる通りです）を組み込み、元来のシグナルペプチドをなくして、目的タンパク質の配列を入れました。 Ｃ末にはＨｉｓタグもついておりますので金属キレートカラムにて培養上清よりアフィニティー精製ができるはずと考えております。 実はその目的タンパク質の活性を電気化学的手法で解析することが 本業で、既に始めているのですが、血液から精製できる量はわずかで いつも材料集めに苦労していました。 そこでどうしてもリコンビナントタンパクを精製したくて今回の発想に至った次第です。 このコンストラクトからタンパクが精製できたとして、 ネイティブなタンパクと同じ生物活性を持つかどうかは分かりませんが とりあえずやってみたいと思います。 ご教授本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.733-13 - 2009/06/24 (水) 18:52:05 - 通りがかり メリチン全長ではなく分泌シグナルだけだと思いますよ。 メリチンの分泌シグナルは昆虫細胞から蛋白を分泌させる時によく使われます。InvitrogenのpMelBac, pMIB等。

(無題) 削除/引用 No.733-12 - 2009/06/24 (水) 18:29:07 - AP >メリチン配列をＰＣＲで挿入したプラスミドを今構築しているところです。 メリチンて、ハチ毒のですか？そうだとしたら、糖鎖付くんでしたっけ？少なくともmature formは全長ほぼ膜貫通ドメインの20アミノ酸残基あまりのペプチドではなかったでしょうか。毒性もあるしうまく発現するかな。前駆体で発現させるのかな。勘違いでしたら読み流してください。

(無題) 削除/引用 No.733-11 - 2009/06/24 (水) 13:49:38 - アルツハイマー伯爵 追加です。 細胞質で起こるグリコシレーションというと、近ごろちょっとホットになっているO-GlcNAc化のことかと思います（単糖が付くだけなので糖「鎖」付加と呼ぶのにはちょっとためらいがありますが）。「O-GlcNAc化」で検索するといろいろと情報が得られると思いますが、ERやGolgiで分泌タンパク質に起こる糖鎖付加とは全く別ものです。 身近に指導者がいらっしゃらないでお困りのご様子ですね。ボスに無理を言ってでも、共同研究として専門家の助言を仰げるようにしておくことを強くお勧めします。ホントに。

(無題) 削除/引用 No.733-10 - 2009/06/24 (水) 13:33:48 - アルツハイマー伯爵 細胞質のタンパク質がグリコシレーションされる場合には、細胞質にある別の糖転移酵素がその反応を触媒します。糖鎖付加という言葉でひとくくりにしていますが、反応も糖鎖構造も触媒する酵素も別ものです。

(無題) 削除/引用 No.733-9 - 2009/06/24 (水) 12:42:39 - AP 誤解のないように付け加えておくと、すべての膜タンパク質や分泌タンパク質がN末のシグナプペプチドを有するのではなく、ペプチドの途中から膜を通過し始めるやつもいます。だからといって、本来、N末にあるシグナルペプチドを真ん中へんに持ってきてもだめでしょう。

(無題) 削除/引用 No.733-8 - 2009/06/24 (水) 12:35:33 - AP スーパーバイザーとか、周りの人で疑義を呈する人はだれもいなかんたんでしょうかねえ。たぶん、たいていの分子生物学の教科書に載っていることなんですが（人気のある、細胞の分子生物学とか）。 最終的なlocalizationがどこであれ、シグナルペプチドはpreformにしかなくてERに入ると切断されます。分泌タンパク質だからとか膜タンパク質だからとかでシグナルペプチドがあるのではなくER移行のためです。私の知る限り、ER移行なしにタンパク質が糖鎖付加される系はないと思います。ついでに言うと、飜訳が完了してからおもむろに移行するのではなく、rER（粗面小胞体）でER膜状のribosomeで飜訳され、出来た分から順次ERに入っていくとされています。シグナプペプチドはある程度ペプチドがER内に入ったら、飜訳の完了を待たずに切断されます。

トピ主です。 削除/引用 No.733-7 - 2009/06/24 (水) 11:48:39 - 分生初心者 アルツハイマー伯爵殿 では分泌タンパク以外の細胞質内に存在するタンパク質の糖鎖付加はどのように行われるのでしょうか？ もちろんその場合にはシグナル配列はないはずですが。 所属する研究室が化学系で分子生物の分野に疎いため ご教授いただけましたら幸いです。

(無題) 削除/引用 No.733-6 - 2009/06/24 (水) 11:34:49 - アルツハイマー伯爵 ヨコですが。 > シグナル配列はＮ末側ではなく、正にＮ末端にないと機能しないのは確かでしょうか？ もちろんです。 > シグナル配列がないとＥＲに入れないのですか？ もちろんです。 研究指導者の方と方針についてもう一度しっかりと話し合われることをお勧めします。

トピ主です。 削除/引用 No.733-5 - 2009/06/24 (水) 11:27:41 - 分生初心者 AP様 シグナル配列はＮ末側ではなく、正にＮ末端にないと機能しないのは確かでしょうか？ さ様 お伺いしたかったのはまさにこの点です。 シグナル配列がないとＥＲに入れないのですか？ DNAI様 メリチン配列をＰＣＲで挿入したプラスミドを今構築しているところです。 （元来のシグナル配列が昆虫細胞でワークするかどうかは定かではありません。 　別のラボでワークしていると口頭で伺いましたが論文にはなっていないもので・・・） 今回のトピックではそれとは別に構築したい系において シグナル配列と糖鎖修飾の関係をお尋ねした次第です。

(無題) 削除/引用 No.733-4 - 2009/06/24 (水) 09:11:07 - DNAI 目的タンパクのシグナル配列が、昆虫細胞でシグナルとしてworkするのは確認済みですか？ バキュロ用ベクターの中で昆虫由来のシグナル配列が付いているものがありますよ。 ベクターを購入するか、PCRでシグナルを挿入するといいと思います。

(無題) 削除/引用 No.733-3 - 2009/06/24 (水) 08:57:50 - さ そしてシグナル配列が機能しないとERに入れず、分泌も糖鎖付加も起こらないですね。

(無題) 削除/引用 No.733-2 - 2009/06/24 (水) 08:53:43 - AP シグナルペプチドはN末から即あってこそなので、N末にタグ配列を付加すると、そもそも機能しないのでは？

分泌と糖鎖付加について 削除/引用 No.733-1 - 2009/06/24 (水) 06:56:01 - 分生初心者 あるタンパク質をバキュロシステムを用いて昆虫細胞で発現しようとしました。 用いたベクターはＮ末にＧＳＴタグ、Ｃ末にＨｉｓタグを発現するもので 目的タンパク質はシグナル配列を持つことから 培養上清よりＨｉｓタグを使ったアフィニティー精製を考えておりました。 （ＧＳＴ−シグナル配列ータンパク質配列ーＨｉｓの順です） ところが収量が思いの外低く、別のコンストラクトの構築を考え始めています。 そこで教えていただきたいのですが、もしシグナル配列をなくしてしまうと 糖鎖修飾はどうなるのでしょうか？ （ＧＳＴ−タンパク質配列ーＨｉｓというのを考えています） ＧＳＴタグのついた糖鎖付加された目的のタンパク質を 細胞ライセートから回収したいと思っているのですが・・・・・ シグナル配列と糖鎖修飾はインディペンデントですか？

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