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(無題) 削除/引用 No.717-6 - 2009/06/21 (日) 16:03:03 - anijya たむたむさん >細胞質でリン酸化され、核に移行すると思いますが、nuclear extractをとってIPするのですよね。 いろいろややこしいので、もう核抽出物も細胞質タンパクも全て可溶化できるようにSDS-sample bufferでとかしたらいいのではないでしょうか？ IRF-7でIPして抗phospho-T/S抗体でいいと思うけどなあ。

(無題) 削除/引用 No.717-5 - 2009/06/21 (日) 15:40:32 - おお >[Re:1] たむたむたいむさんは書きました : > マウスの骨髄由来の樹状細胞 (DC)のCpG-Aによるリン酸化を見たいのですが、マウスではリン酸化特異的な抗体が市販されていないようなのですが、 ヒトに対しては抗体があるのでしょうか? そうした場合エピトープ部位の配列はマウスと一緒でしょうか? ヒトの遺伝子を一過性に発現して、それが燐酸かされているという 方法を取れるでしょうか? 特異的抗体IPでanti-P-serineで検出は燐酸かしたことは示せますが、 何処が燐酸かされたか分からないので、状況しだいたいだとおもいます。 色々な実験や、報告から総合的な判断としてそう言えるかどうかという 事です。燐酸かすると考えられるキナーゼのインヒビターで裏をとるとか いうのもありますね。 核移行とかいろいろお考えのようですが、その程度知識があるのでしたら、 一度ご自身でよくお考えになれば良いかと思います。 多分それができる位の方とお見受けします。

anijyaさんへ 削除/引用 No.717-4 - 2009/06/21 (日) 15:24:55 - たむたむたいむ anijyaさん、お返事感謝致します。 Immunoblotをanti-IRF-7抗体でみるときは、もちろん、リン酸化型の高分子量のものの出現をみるということですよね。それが一般的と思いますが、その高い分子量のものが、リン酸化型というのは、当然と考えていいのでしょうか？それと、もしよろしければ、細胞質でリン酸化され、核に移行すると思いますが、nuclear extractをとってIPするのですよね。となると、lysisバッファーを選ばなければならないと思いますが、RIPAバッファーあたりがおすすめでしょうか？すいません。ながながと。

(無題) 削除/引用 No.717-3 - 2009/06/21 (日) 14:49:06 - anijya まあそうですね。 部位特異的リン酸化抗体がない場合には、IP（IRF-7）->IB(IRF-7 またはphospho-T/S)でやればオーケーです。 部位特異的リン酸化抗体がない時代あるいは、今でも目的のタンパクの部位特異的リン酸化抗体がない場合にはそれが定法だと思います。 ってか部位特異的なものかを示したいのであれば、そういった抗体は有用かもしれませんが、ただ刺激でIRF-7がリン酸化されるかどうかだけを判断したいのなら上記した方法で全く持って問題ないと思いますが、如何でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.717-2 - 2009/06/21 (日) 13:18:41 - たむたむたいむ すいません、検出したいのは、IRF-7です。よろしくお願い致します。

IRF-7のリン酸化 削除/引用 No.717-1 - 2009/06/21 (日) 13:15:54 - たむたむたいむ マウスの骨髄由来の樹状細胞 (DC)のCpG-Aによるリン酸化を見たいのですが、マウスではリン酸化特異的な抗体が市販されていないようなのですが、このような場合どのようにして検出するのがよいのでしょうか？serineがリン酸化されるとの報告があるので、常法どうり、IRF-7を免疫沈降して、anti-phoshoserineの抗体で検出するというのが一般的かともお思いますが、どなたか経験ございましたら、教えてください。

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