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(無題) 削除/引用 No.709-5 - 2009/06/20 (土) 20:32:10 - けろろ �@�Aに答えます。 結局のところ、その抗体が特異的であることを示すには、ＫＯで免疫染色して完全に消えることを示す（消える条件を探す）ことしかありません。 条件つきで siRNA でも可能です。

(無題) 削除/引用 No.709-4 - 2009/06/20 (土) 17:28:55 - AP >ウエスタンでバンドがいくつか出る抗体を免疫染色に使って、なぜ「そのタンパクが染まっている」という結論が出せるのか？ 変性タンパク質を相手にするウェスタンと、ネイティブに近いIHCでは反応性が違う場合もあるので、ウェスタンで交差反応が見られるからIHCでも交差反応が起こるとは一概にはいえないと思います。 免疫染色の特異性を証明する古典的方法としては、精製標的タンパク質標品で抗体を前吸収すると、染色が見られなくなることを示すというのがあります。 >購入した抗体を使えるようにする方法はあるか？ 以前のトピでも何度か触れられていますが、標本と同じ材料をアセトンパウダーにしたり固定処理したもので抗体を前吸収しておくというのはかなり有効です。使用済みを希釈抗体を捨ててしまわずに、回収して何度も繰り返し使うというのも同様の効果があり、抗体の節約にもなります。標的タンパク質に正しく反応する抗体も減ってきますが、交差反応する抗体が除けてS/Nが良くなるので、かえって感度が上がったように見えることが多いです。

(無題) 削除/引用 No.709-2 - 2009/06/20 (土) 11:51:42 - 小児科医師（ゆとり教育） それぞれの質問に答えて行きます。 １．他の論文で使われている抗体を使います。複数の抗体が使われているようなら、いつも自分が使っている会社の抗体や抗体の質がよいといわれている会社の抗体を使います。私はCell　Signaling社がお気に入りです。 ２．複数バンドが出てしまう場合には、Blocking時間を長くしたり、抗体濃度を薄くしたりして、できる限り1本バンドになるようにします。それでも複数バンドが出てしまう場合には標準となるMolecular　Weightを一緒に流して分子量から目的の蛋白を同定します。 ３．抗体が使えるか使えないかはほとんど運みたいな部分もあるので、どの会社の抗体を購入すべきかを十分吟味する必要があります。ウェスタンも免疫染色も、一次抗体が命です。 ウェスタンのデータは目的のバンドの部分だけFigureにするのが慣例なのでご指摘のとおり、エクストラバンドが出たのかどうかは分かりませんね。

免疫染色の抗体 削除/引用 No.709-1 - 2009/06/20 (土) 05:50:12 - トラリアム 最近分子生物学を始めたばかりの初心者です。 今度はじめて免疫染色を行う予定で、とりあえず論文で使われている抗体（アフィニティクロマト精製品、非標識）を購入してみました。その抗体を使ってウエスタンブロットをしてみると、目的タンパク質のバンド以外に数本何か分からないバンドがありました。 電気泳動の先端部のラインも結構濃く染まっていました。 免疫染色とウエスタンでは染まり方が違うかもしれませんが、この抗体使って免疫染色しても目的のもの以外が染まって正しい結果が出ないと思います。同じ抗体使っている論文の染色パターンも本当に正しいのか疑問です。何本か免疫染色している論文見たところ、染まっているパターンが論文によってちょっと違います。 他にも同じタンパク質に対する抗体（全て論文で免疫染色に使っているもの）を数本購入して、とりあえずウエスタンでバンドが一本しかでない抗体を探したのですが、全ての抗体で何本かバンドが出てしまいました。 そこで質問なのですが、 �@免疫染色に使える抗体をどうやって選ぶのか？ �Aウエスタンでバンドがいくつか出る抗体を免疫染色に使って、なぜ「そのタンパクが染まっている」という結論が出せるのか？ �B購入した抗体を使えるようにする方法はあるか？ をどなたか教えていただけませんでしょうか？ ちなみに論文ではウエスタンのデータもありましたが、なぜかバンドのとこだけ切り取ってあるので、エクストラバンドがあるのかないのか分かりません。購入した抗体は全てアフィニティ精製品、非標識です。ウエスタンはHRPで検出を行い、免疫染色はFITCかローダミンで検出する予定です。

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