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(無題) 削除/引用 No.699-11 - 2009/06/26 (金) 11:26:22 - Taku この DT-A 遺伝子には poly-A シグナルが付いていないので、transient に発現した mRNA はすぐに分解され、一方ゲノムに組み込まれた場合には近傍の poly-A シグナルを利用して持続的に発現するというコンセプトだったと思います。 詳しくは相沢先生の原報を参照されるといいでしょう。 実際、私もDT-A コンストラクトを使って普通にマウスを作成していますので、大きな影響がないのは確かです。 > 今用いているES細胞はtargetingなどをせずにすぐにアグリゲーションしても、50%程度のキメラしか生まれてきません。 何度やっても50%程度なら、ちょっと質が悪いと思います。germline transmission は確認できますか？

(無題) 削除/引用 No.699-10 - 2009/06/26 (金) 10:34:45 - TQ 以前TT2を使用していましたが、 100%毛色みたいなのはあまりいなくて、 70%〜100%くらいで高率にgermlineに乗るキメラが得られていました。 30%くらいでもGermlineに乗っていた経験があります。 他のES細胞株でも同じだと思うのですが、 継代数を重ねると、高率キメラが得られにくい傾向にあるようです。 また、ストックを作製したロットによっても違いがありました。 その場合は、ストックを作製しなおすが、 継代数の若いロットを分与してもらうことをお勧めします。 negative selection（DT-A)に関しては、 キメラマウス作製への影響はおそらくないと考えています。 targetingされたES細胞には導入されていないはずですので。 HSV-tkの導入は、生殖細胞に有毒で雄性不妊を生じるとどこかで読んだ気がしますが。（出典忘れました） 実際、DT-A,HSV-tk,どちらも使用してますが、どちらを使用した場合でも、targetingされたES細胞を用いてキメラマウスが得られています。 好みで使い分ければ良いのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.699-8 - 2009/06/26 (金) 00:02:18 - TT もちろん目的はGermlineに通すことです。 ただ、今までの例からすると、明らかに毛色が100%近いものがgermlineに乗っていますのでキメラ率が低い事に困惑しています。 特に現在用いているESはTT2で、文献上は毛色良いものは非常に良い確率でgermlineにのるけれども、低いものはほとんど乗らないという特徴があるようです。

(無題) 削除/引用 No.699-7 - 2009/06/23 (火) 17:43:31 - おせっかい TRさん、横レスですが、TTさんは導入された遺伝子が組換え前にtransientに発現してしまって悪影響を与える可能性についてお尋ねなんですよ。

(無題) 削除/引用 No.699-6 - 2009/06/23 (火) 17:34:16 - TR DT-Aは相同領域の間に入っているのですか？ それとも相同領域の端に付いていますか？ 普通、DT-Aが挿入されると細胞が死んでしまうので、相同領域の端に付けてあり、相同組換え体ではDT-Aが抜けている（非相同組換え体ではDT-Aにより細胞が死ぬ）と思うのですが？

(無題) 削除/引用 No.699-5 - 2009/06/22 (月) 11:32:10 - TS ちょっと気になったのですが、 TT様の目的はES細胞をGerm cell lineに通すことなのですよね？ 経験上、確かに毛色のキメリズムの程度はGerm cell lineの通りと相関があると思います。 しかし、キメリズムが高いからといって必ずGerm cell lineに通るわけでもありません。高キメリズムなのにGerm cell lineに通らないと頭を抱えている方は結構います。 生殖細胞は外胚葉から生じるわけではないので、毛色はあくまで指標の一つです。 キメリズムが低くてもGerm cell lineに通るのであれば、気にせずそのES細胞を使用すればよいのではないでしょうか。 ちなみに自分の使用しているES細胞はInjectionの度にキメリズムはまちまちで、３０〜９５％とかなり幅があります。 今のところはこのキメリズムでGerm cell lineに通らなかったことはありません。

追加 削除/引用 No.699-4 - 2009/06/21 (日) 12:27:36 - TT すみません。追加で質問させていただきたいのですが、今用いているES細胞はtargetingなどをせずにすぐにアグリゲーションしても、50%程度のキメラしか生まれてきません。 targetingの時にモノクローンになるのでこれくらいで良いのかと思っていたのですが、皆さまの使っているESもこのような感じなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.699-3 - 2009/06/21 (日) 12:22:48 - TT TS様ありがとうございました。 とりあえず継代数の若いESを起こしなおしてやり直してみることにします。

(無題) 削除/引用 No.699-2 - 2009/06/19 (金) 13:00:37 - TS KOやKIの作製にDT-Aを付加したTargeting vectorを用いているものです。 DT-Aを用いても高率キメラはしっかりと取れてきています。 今までの経験から、高率キメラが取れなくなる原因はほとんどES細胞自体です。 急にキメラ効率が悪くなったりした時は、 継代数の若いES細胞を起こし直して使うことをお勧めします。 あと、使用する人が代わるだけで途端にキメラが取れなくなったりすることもあります。 最初は系を熟知している人にES細胞の扱いを指南してもらうのがベターではないでしょうか。

DT-Aの毒性について 削除/引用 No.699-1 - 2009/06/19 (金) 01:17:29 - TT いつもお世話になっています。 DT-Aでnegative selectionし、ESにtargetingを行っています。 組み換え体は25%程度の確率で得られるのですが、高率キメラが生まれません。 たまたまかなと思っていたのですが、うまくいっている人のtargeting vectorをみると、selection markerをつけていなかったりHSV-tkを使ったりしている確率が高いような気がしました。 そこで思ったのですが、DT-Aはelectroporation後transientに発現すると思うのですが、これによる毒性はどの程度と考えられているのでしょうか？ よろしくお願いいたします。

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