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Blue/White Selectionについて トピック削除
No.696-TOPIC - 2009/06/18 (木) 16:14:00 - Pumpkin
いつも大変お世話になっております。
表題にある件について皆様のご意見を伺いたく思います。

lacZを持つクローニングベクターの(lacZ中にある)マルチクローニングサイトのSma1とXba1でそれぞれ切断し、平滑末端と付着末端にしたこのクローニングベクターをゲルより切り出して精製しました(サイズは約3kb)。

ここへ、lacZのフレームが合うような長さのSma1とXba1の切断形状を持つDNA断片を用意しました(サイズは30bp)。

これらベクター及びインサートをライゲーションし、形質転換体を得ました。予想通りほとんど(90%近く)青コロニーでしたが、青白ともに8つづつベクター側からインサートを挟むように設計したプライマーセットでコロニーPCRを行ったところ、すべてのサンプルで同じ増幅産物が得られました。どうしてこのような結果が得られたのかが分かりません。Sma1及びXba1で消化する前のベクターをポジコン、ベクターなしをネガコンとしておりますが、これらに問題はないのでPCRのworkは問題ありません。

前々からコロニーPCRの是非についてはフォーラム中で議論されているところであること、また、こちらとしましては、やはり制限酵素による消化やシークエンスによる確認をする必要があることを認識しており、そのように実験を進めております。ただ、どうしてこのような解が得られるか、皆様のお知恵を借りられればと思います。
 
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(無題) 解決済み 削除/引用
No.696-11 - 2009/06/19 (金) 00:05:47 - Pumpkin
AP様
宿主の件、気になりますのでご意見を頂いたとおりM9で見てみたいと思います。こういうことでもない限り、なかなか見ようと言うことがありませんから。

~様、あべちゃん様もご意見ありがとうございました。

クローニングというか、今回の目的のベクター構築はまったく問題なく行われたのですが、どうしてそのような結果がありうるのかについて疑問を解決しておきたいな、と思った次第です。実は11bp抜いて30bp入れてなんでフレームが合うのかといった質問が来なかったことを感謝しています(制限酵素消化面のところを合わせて書いていないので合わないのですが、厳密にかけばフレームが合います。ちょっと説明がめんどくさかったので)。

皆様、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.696-10 - 2009/06/18 (木) 19:40:26 - AP
>2は、JM109ですが、確かに可能性はあるかもしれません。ただ確認のしようがないですね。

JM109なら、大いに可能性があります。市販品のコンピならある程度、性能は保証されている、あるいはちゃんとF'選択をしたシングルコロニーから調製しました、といっても、そのくらいの頻度ではF'が落ちるんじゃないかなあ。

ひろったコロニーをM9 (plus thiamin) plateに植えてみたらどうですか。F'のせいなら、白コロニーは生えないはず。あるいは、それぞれからプラスミドを精製して、形質転換しなおしてみるとか。宿主が原因であればそれで、100%ではないにしても、青いコロニーが出てくるはず(XL-BlueなどDH5alphaなどlacZ Delta15が落ちない系統なら100%青くなるはず)。プラスミドが原因なら、それでもやっぱり青コロニーは一つも出ないはず。

(無題) 削除/引用
No.696-9 - 2009/06/18 (木) 19:22:45 - あべちゃん
> ベクターのみのAmpliconは、179bp
> 形質転換由来のAmpliconは、209bp
> でその差30bpですが、3%アガロースゲルでしっかりと分離できているので問題ないと思っています(長めのゲルで分離して、分離能を確保しています)。
>
> ベクターは約3kbでSma1とXba1で切り出される断片サイズは11bpですので、電気泳動的には切り出されたかは確認できていませんが、supercoil formからliniearになっているのは電気泳動的に確認しています。

Pumpkinさん、
MCSのSma1とXba1の間が30bp前後で、そこに30bp挿入したのかと、疑ってしまいました。失礼しました。

(無題) 削除/引用
No.696-8 - 2009/06/18 (木) 18:12:56 - Pumpkin
AP様

1は、その後も培養を続けたプレートや冷蔵したプレートなどもありますが、変化がないので違うかなと思います。

2は、JM109ですが、確かに可能性はあるかもしれません。ただ確認のしようがないですね。

3が一番有力なのかなぁ、っと思います。シークエンスしてみます。

(無題) 削除/引用
No.696-7 - 2009/06/18 (木) 17:31:07 - AP
3. 合成オリゴに不正な配列のものがある程度の頻度で含まれていたため、同じくらいのインサートが入っていてもフレームがずれていたり、ストップが入ったりしてのかもしれない。

(無題) 削除/引用
No.696-6 - 2009/06/18 (木) 17:28:26 - AP
1. 白コロニーはたまたま発現が遅れているだけで、時間をおけば青くなったかもしれない。

2. F'が抜けている宿主菌が混じっていて、青くなるべきプラスミドでも青くならなかった(使った宿主によっては結構有力)。

(無題) 削除/引用
No.696-5 - 2009/06/18 (木) 17:00:53 - Pumpkin
あべちゃん様

ベクターのみのAmpliconは、179bp
形質転換由来のAmpliconは、209bp
でその差30bpですが、3%アガロースゲルでしっかりと分離できているので問題ないと思っています(長めのゲルで分離して、分離能を確保しています)。

ベクターは約3kbでSma1とXba1で切り出される断片サイズは11bpですので、電気泳動的には切り出されたかは確認できていませんが、supercoil formからliniearになっているのは電気泳動的に確認しています。また、このベクターがセルフライゲーションを起こさないことから、両制限酵素による消化と切り出される小断片は分離できていると思います。

ご指摘の通り、PCRによる検定は可能ですが、挿入したインサートだけを切り出しての電気泳動は困難だと思っております。確認にはちょうど良いサイズになるベクター内制限酵素との組み合わせもしくはインサート内に1つだけ切断部位を持つ酵素で切断して確認を行います。

(無題) 削除/引用
No.696-4 - 2009/06/18 (木) 16:52:36 - あべちゃん
消化前のベクターを鋳型にしたPCR産物のサイズと
形質転換体由来のPCR産物産物のサイズはいくつですか?

Sma1とXba1でベクターを切ったとき、切り出される小さい断片は何bpですか?

挿入した断片30bpとの正味の差はいくらですか?

その差し引きした後、元ベクターとインサート入りベクターとで、予想されるPCR断片のサイズの差を十分に分離できる条件(ゲル濃度、ゲルの種類など)は、適切ですか?

(無題) 削除/引用
No.696-3 - 2009/06/18 (木) 16:49:23 - Pumpkin
~様のおっしゃる通りで、ベクターないしインサートの両端に削り込みが起きてライゲートされていれば起こりうる話だと思います。

ただ、先に示したような作り方で末端が削られることはあるのでしょうか。ちょっと異なりますが、もし、スター活性のように認識部位以外が消化されれば、同じAmpliconにもならないはずです。

先ほどの中で一点ご説明していなかったのですが、インサートはオリゴ2種をアニールして作製しておりますので削り込みなんかは起きないと思います。ただ、精製は簡易カラム精製しかしていないので、それとベクター側が削られたものなんかができるとありえない話ではないかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.696-2 - 2009/06/18 (木) 16:40:38 - ~
何も考えずに答えると、
SmaI側が1~数bp削れてライゲーションしていれば、
そのような結果になってもおかしくありませんよね。

Blue/White Selectionについて 削除/引用
No.696-1 - 2009/06/18 (木) 16:14:00 - Pumpkin
いつも大変お世話になっております。
表題にある件について皆様のご意見を伺いたく思います。

lacZを持つクローニングベクターの(lacZ中にある)マルチクローニングサイトのSma1とXba1でそれぞれ切断し、平滑末端と付着末端にしたこのクローニングベクターをゲルより切り出して精製しました(サイズは約3kb)。

ここへ、lacZのフレームが合うような長さのSma1とXba1の切断形状を持つDNA断片を用意しました(サイズは30bp)。

これらベクター及びインサートをライゲーションし、形質転換体を得ました。予想通りほとんど(90%近く)青コロニーでしたが、青白ともに8つづつベクター側からインサートを挟むように設計したプライマーセットでコロニーPCRを行ったところ、すべてのサンプルで同じ増幅産物が得られました。どうしてこのような結果が得られたのかが分かりません。Sma1及びXba1で消化する前のベクターをポジコン、ベクターなしをネガコンとしておりますが、これらに問題はないのでPCRのworkは問題ありません。

前々からコロニーPCRの是非についてはフォーラム中で議論されているところであること、また、こちらとしましては、やはり制限酵素による消化やシークエンスによる確認をする必要があることを認識しており、そのように実験を進めております。ただ、どうしてこのような解が得られるか、皆様のお知恵を借りられればと思います。

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