マウスの脳より単離したミトコンドリアに、カルシウムを曝露してミトコンドリアからシトクロムCの流出をウェスタンブロッティングで観察したいと考えています。
プロトコールといたしましては、
1.マウスより全脳を摘出後、320 mMスクロース中、ポッター型ホモジナイザーを用いて400rpm、10回ストローク。
2.1000g遠心上清を、12500gで遠心し、沈殿を粗ミトコンドリアとする。
3.粗ミトコンドリアをKCl medium（125 mM KCl, 2 mM K2HPO4, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES）で懸濁。
4.粗ミトコンドリアを100 ugずつ分注後、カルシウム存在下28℃でインキュベーション。
5.12500gで遠心後、上清と沈殿に分けてSDS処理しウェスタンサンプルとする。
上記のような方法を用いまして実験しておりますが、ウェスタンによる検出がうまくいきません。ウェスタン自体は他のサンプルでうまくいっています。可能性といたしましては、高カリウム溶液をSDS処理するときおよびゲルにアプライするときに沈殿を生じてしまったので、カリウムが原因かと考えておりますが、お聞きしたいことといたしましては、
・カリウムバッファーで無いとうまくミトコンドリアの反応は観察できないのか？
・さらにミトコンドリアをピュリファイすべきか？
ということです、皆様のご意見をお聞かせ願えれば幸いです。
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