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5kDa位の合成ペプチドをゲル上で検出 トピック削除
No.691-TOPIC - 2009/06/18 (木) 07:00:40 - おお
5kDa位の合成ペプチドをゲル上で検出しようとしています(SDSPAGEではないですがPAGE上です)。
どういうわけかかなり載っけているはずなのですが、ほかの20kDa位のタンパク
と比べて銀せんで弱いです。そこでこれを検出する方法として
ほかの方法も考えたいと思っています。

Znなどのを使うネガティブ染色とかありますが、小さいペプチドとかどうでしょうか。うーんCBBでも染まるほどの量のはずだからCBBで染めてみるかなあ、、、、

いろいろ考えていますが、何らかの関係した経験をおもちのかたとか
いましたら何でもいいですからコメントください。

経験上の話以外でも歓迎いたします。
　
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No.691-6 - 2009/06/19 (金) 07:37:25 - おお
>[Re:3] anshinさんは書きました :
> 30アミノ酸くらいのペプチドをSDS−PAGEして、CBB染色したことがあります。そのペプチドはLysが含まれておらず、Argも1残基だけでした。驚いたことに、CBBで染色すると、染まるんですが、通常の脱色操作で、バックをきれいにしようとすると、染色されたバンドもきれいに消えてしまいました。再び染色するとバンドは確認できたので、固定はされていたんでしょうけど、脱色操作の最初のほうで急いで写真とりました。
>
> CBBはLysとかArgがないと染まりにくい（染まらない？）という報告もあるみたいですけど、
>
> JBC　Vol.260、9976−9980（1985）
>
> 上記のことが本当なら、Argへの結合は可逆的なんでしょうかね？
>
> というわけで、CBBで染色されるのであれば、アミノ酸組成を気にされたほうがいいと思います。

貴重な経験に基づいた話をいただきました。
CBBは塩基性のアミノ酸につくという話は聞いたことがあります。
塩基せいでもなくても疎水性やパイ電子相互作用(ベンゼン間などのスタック)
で結合する事もあるんでしょうね。ただそれだけでは弱いのかもしれません。

アミドプラックなども使われることがあるようですので、どちらにしようかとか混ぜちゃおうかとか悩んでます。

脱色も注意ですか、、、どうなんでしょうね、水で脱色する人もいますし、、
スルホン基がついてますので電離をしない条件のほうがタンパクの結合
がいじされるかなぁ、、、

塩基性のアミノ酸は、、、2つしかありませんでした末端のアミノ基が反応
してくれても3カ所ですか、、、、

(無題) 削除/引用
No.691-5 - 2009/06/19 (金) 06:33:55 - おお
みなさんありがとうございました。
ちょっと調べてみましたら、銀せんはアミノ酸ざんきの
SHだとかカルボキシルきとかがターゲットになるという
記述がありました。
CBBご指摘にもあるように塩基せいアミノ酸にしん和性が
あるようです。
気付いていてはいたのですが、アミノ酸組成を見てみる
べきですね。

(無題) 削除/引用
No.691-4 - 2009/06/18 (木) 19:18:43 - あべちゃん
>[Re:3] anshinさんは書きました :
> CBBはLysとかArgがないと染まりにくい（染まらない？）という報告もあるみたいですけど、
>
> JBC　Vol.260、9976−9980（1985）
>
> 上記のことが本当なら、Argへの結合は可逆的なんでしょうかね？
>
> というわけで、CBBで染色されるのであれば、アミノ酸組成を気にされたほうがいいと思います。

anshinさん、
cytochrome cとpepsinで5倍も結合力が違うんですね。勉強になりました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.691-3 - 2009/06/18 (木) 19:05:38 - anshin
30アミノ酸くらいのペプチドをSDS−PAGEして、CBB染色したことがあります。そのペプチドはLysが含まれておらず、Argも1残基だけでした。驚いたことに、CBBで染色すると、染まるんですが、通常の脱色操作で、バックをきれいにしようとすると、染色されたバンドもきれいに消えてしまいました。再び染色するとバンドは確認できたので、固定はされていたんでしょうけど、脱色操作の最初のほうで急いで写真とりました。

CBBはLysとかArgがないと染まりにくい（染まらない？）という報告もあるみたいですけど、

JBC　Vol.260、9976−9980（1985）

上記のことが本当なら、Argへの結合は可逆的なんでしょうかね？

というわけで、CBBで染色されるのであれば、アミノ酸組成を気にされたほうがいいと思います。

(無題) 削除/引用
No.691-2 - 2009/06/18 (木) 10:36:11 - あべちゃん
5kDaというサイズよりもアミノ酸残基の組成が影響しているんじゃないですか？
疎水性アミノ酸残基が多い蛋白質で、銀染ではほとんど染まらない蛋白質があります。
呼吸鎖系の蛋白質でいくつかありました。

でも、CBBで染まりそうなくらい量があるのであれば、素直にCBBするのが第1手だとおもいます。
CBBは銀染に比べれば、蛋白質による染まりの差は大きくないです。

銀染特有の染まりにくさと別の理由のとき、例えば、Cys残基に蛍光ラベルを入れるなどすれば、感度はぐっと上げられますよね。

5kDa位の合成ペプチドをゲル上で検出 削除/引用
No.691-1 - 2009/06/18 (木) 07:00:40 - おお
5kDa位の合成ペプチドをゲル上で検出しようとしています(SDSPAGEではないですがPAGE上です)。
どういうわけかかなり載っけているはずなのですが、ほかの20kDa位のタンパク
と比べて銀せんで弱いです。そこでこれを検出する方法として
ほかの方法も考えたいと思っています。

Znなどのを使うネガティブ染色とかありますが、小さいペプチドとかどうでしょうか。うーんCBBでも染まるほどの量のはずだからCBBで染めてみるかなあ、、、、

いろいろ考えていますが、何らかの関係した経験をおもちのかたとか
いましたら何でもいいですからコメントください。

経験上の話以外でも歓迎いたします。
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