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(無題) 削除/引用 No.690-22 - 2009/06/19 (金) 21:32:16 - wine > 何も考えずに，どちらの培地も1から作りましょう． > 細胞が生きる死ぬはその後です． > 作り直すときに，その培地がフェノールレッドが入っているのかどうか， > 確認してください．フェノールレッド無添加の培地は， > 薄い黄色透明で，血清を入れると黄色が少し濃くなります． > まあ塩基性に持っていってピンクになれば，フェノールレッドは > 入ってると思いますが・・・ 担当教員の指示で培地の再作製はせずに、そのまま培養を続けています。今回使用の培地はフェノールレッド含有でした。他の方への返信にも書きましたが、粉末培地自体の添加に問題があったと思われます。

(無題) 削除/引用 No.690-21 - 2009/06/19 (金) 21:29:31 - な > 血清入り培地（これは一応色が変化した。）は細胞の顕著な増殖は見られなかったものの正常でしたが、無血清培地（色が透明だった問題の培地。）では完全に細胞が弱っていました。 あ、いやいや、~さんがHelaは無血清では死ぬといってますし、P3X63Ag8は私が使ってますが無血清ではすぐに死ぬ細胞です。だから、これは判定材料になりません。私としては、前回血清入りでもP3X63Ag8.653が増えなかったと言うことで、とりあえず培地以外の操作が原因かどうかが気になったのです。今回は同じ血清入り培地で大丈夫だったということは、複数因子があるようです。 無血清培地の謎は、これにNCSをいれて、細胞が育つかどうかみてはどうでしょうか。先生がそれを許可するかどうかはわかりませんが。

(無題) 削除/引用 No.690-20 - 2009/06/19 (金) 21:28:47 - wine > 私が使ったことのあるMEMよりもフェノールレッドの濃度が薄くて、黄色には見えないのかもしれませんね。 今日教員に確認したところ、使用した培地は 日水製薬株式会社 イーグルMEM培地「ニッスイ」 カナマイシン・フェノールレッド含有、L-グルタミン・炭酸水素ナトリウム不含 でした。 > > >納得するまで調べたいのです。 > この先はネット上で調べるのは無理だと思いますが。 > どうなったら納得がいくのでしょうか？ 当初私は粉末培地を作製してくれた子を信用して、粉末培地が含まれているということを前提に、なぜ透明のままだったのかを知りたいと思いました。 しかし、皆様からのご意見をいただいていくうちに、その理由は単純に粉末培地の添加ミスにあるという結論に至り、ようやく腑に落ちた心地がいたします。とにかくフェノールレッド含有の状態で色の変化がないということはありえないのですね。それは至極当然なことであるのかもしれないのですが、まだまったく無知な私にとっては培地が透明だったことからそこへと瞬時につなぐことができませんでした。 > > 貴方の所属する学科に、 > １．グルタミン酸などを計れるBioanalyzerなど > ２．グルコースを計れる血糖値測定器など > ３．MEMの成分のうち1つ以上をある程度の誤差の範囲で測定できる機器 > 　（MEMが入っていなければ各成分の濃度が薄いはず） > ４．浸透圧計 > 　（MEMが入っていなければ浸透圧が低いはず） > ５．少量のサンプルを計れるpHメーター > 　（MEMが入っていなければ重炭酸ナトリウムでアルカリに偏っているはず） > などはありませんか？ > > それらのうちのどれかで貴方の無血清MEMと他の班の無血清MEMを測定し、 > 結果を比較すれば培地中の成分の濃度が異なるかどうかは分かるでしょう。 残念ながら私の所属する専門学校にはありません。来年大学に進学したらそれらの機械はあるのでしょうか。機械があったら是非調べてみたいです。 > > > > 今日は６５３細胞と同様の方法でHeLa細胞を培養 > 653細胞は使ったことがありませんが、 > 少なくともHeLaは無血清のDMEMでは死にました。MEMでも同じでしょう。 > (前に継代した時の培地がある程度残っていれば死なないかもしれません) > > そのため、この評価方法では、問題の無血清のMEMが適切に調整されたのかを判断するのは難しいと思います。 > （他の班の細胞と比較して死に方を比べるという評価ができるかもしれませんが微妙な差になると思います） すみません、また誤解を招いてしまいましたね。HeLa細胞では操作自体は653細胞と同様だったのですが、培地はFBS入りの培地のみを使用しました。 ~さん 私は高校卒業まで人文科学系に進むつもりで大学受験の勉強をしていました。しかし、あるきっかけで卒業直前に理転し、今の専門学校に入学して生命科学の分野に足を踏み入れ、やっと１年が過ぎました。まだまだ知識が浅く、実験技術も未熟で、~さんのご意見にお答えするのにも至らぬ部分が多々あったと思います。私は今後大学、大学院に進学して、研究の道に進みたいと思っているのですが、今回の~さんのご意見は今後の貴重な糧になりました。実験に対して真摯な態度で望む大切さを改めて感じさせていただくことができました。この度は大変勉強になりました。本当にどうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.690-17 - 2009/06/19 (金) 20:56:16 - wine > > 今日は６５３細胞と同様の方法でHeLa細胞を培養したのですが、今までの反省を生かして十分に気をつけて操作を行ったところ、大変上手くいきました。 > > このときのメディウムは前と同じものなのですか？それとも作り直しました？wineさんの結論として、培地に問題があったのか、それ以外の操作のところなのかわかりました？ HeLa細胞は私がFBS入りの培地を作り直して培養しました。 今、昨日２つの培地に別に入れた他班の細胞を確認したところ、血清入り培地（これは一応色が変化した。）は細胞の顕著な増殖は見られなかったものの正常でしたが、無血清培地（色が透明だった問題の培地。）では完全に細胞が弱っていました。 よって、上記の結果やみなさんから色の変化がおこらないということはフェノールレッドが入っていない限りないと教えていただいたことなどから判断して、培地を作製した子が粉末培地を入れなかった、もしくは必要量より少ない培地しか入れなかったために細胞を培養しうる培地が作製できずに今回の結果となったと思われます。 今回の件を反省して、今後の実験に十分に生かしていきたいと思います。 この度は貴重なアドバイスをご丁寧にしていただいて本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.690-16 - 2009/06/19 (金) 10:44:33 - よっしー 何も考えずに，どちらの培地も1から作りましょう． 細胞が生きる死ぬはその後です． 作り直すときに，その培地がフェノールレッドが入っているのかどうか， 確認してください．フェノールレッド無添加の培地は， 薄い黄色透明で，血清を入れると黄色が少し濃くなります． まあ塩基性に持っていってピンクになれば，フェノールレッドは 入ってると思いますが・・・

(無題) 削除/引用 No.690-15 - 2009/06/19 (金) 10:16:27 - ~ 私が使ったことのあるMEMよりもフェノールレッドの濃度が薄くて、黄色には見えないのかもしれませんね。 >納得するまで調べたいのです。 この先はネット上で調べるのは無理だと思いますが。 どうなったら納得がいくのでしょうか？ 貴方の所属する学科に、 １．グルタミン酸などを計れるBioanalyzerなど ２．グルコースを計れる血糖値測定器など ３．MEMの成分のうち1つ以上をある程度の誤差の範囲で測定できる機器 　（MEMが入っていなければ各成分の濃度が薄いはず） ４．浸透圧計 　（MEMが入っていなければ浸透圧が低いはず） ５．少量のサンプルを計れるpHメーター 　（MEMが入っていなければ重炭酸ナトリウムでアルカリに偏っているはず） などはありませんか？ それらのうちのどれかで貴方の無血清MEMと他の班の無血清MEMを測定し、 結果を比較すれば培地中の成分の濃度が異なるかどうかは分かるでしょう。 > 今日は６５３細胞と同様の方法でHeLa細胞を培養 653細胞は使ったことがありませんが、 少なくともHeLaは無血清のDMEMでは死にました。MEMでも同じでしょう。 (前に継代した時の培地がある程度残っていれば死なないかもしれません) そのため、この評価方法では、問題の無血清のMEMが適切に調整されたのかを判断するのは難しいと思います。 （他の班の細胞と比較して死に方を比べるという評価ができるかもしれませんが微妙な差になると思います）

(無題) 削除/引用 No.690-14 - 2009/06/18 (木) 22:02:23 - な > 今日は６５３細胞と同様の方法でHeLa細胞を培養したのですが、今までの反省を生かして十分に気をつけて操作を行ったところ、大変上手くいきました。 このときのメディウムは前と同じものなのですか？それとも作り直しました？wineさんの結論として、培地に問題があったのか、それ以外の操作のところなのかわかりました？

(無題) 削除/引用 No.690-13 - 2009/06/18 (木) 21:58:19 - wine > グルタミンや重炭酸ナトリウムやNCSを入れる前の培地の色は、 > 無血清用に使うMEMと血清添加用のMEMで同じ色ではなかったのですか？ > それとも無血清用のMEMが透明で、血清添加用のMEMが黄色だったのですか？ 両方とも何も添加していない状態では透明でした。 > また、他の班の無血清用のMEMも、もともと黄色ではなく貴方の班と同じ透明な色で、重炭酸ナトリウムを入れたらピンクになったのですか？ 他の班も同様に透明でした。その通りです。 > 黄色のままではなく、終始透明だったのですよね。 > 黄色でも赤でもない時点でおかしいと思いませんか？ もちろん思いました。培地の作り直しを担当教員に何度も打診しましたが、問題ない操作を早く進めろとのことだったので不安を抱えつつ操作をそのまま続けました。そして最終的にこのような結果になったので、納得するまで調べたいのです。

各ステップの各培地の色をまとめて欲しいです 削除/引用 No.690-12 - 2009/06/18 (木) 21:37:06 - ~ 書いた後でな さんの書き込みと重複していることに気づきましたが、 そのまま書き込みます。 --------------------------------- グルタミンや重炭酸ナトリウムやNCSを入れる前の培地の色は、 無血清用に使うMEMと血清添加用のMEMで同じ色ではなかったのですか？ それとも無血清用のMEMが透明で、血清添加用のMEMが黄色だったのですか？ また、他の班の無血清用のMEMも、もともと黄色ではなく貴方の班と同じ透明な色で、重炭酸ナトリウムを入れたらピンクになったのですか？ >酸性〜中性では黄色、アルカリ性で赤 そのとおりです。おそらく貴方のMEMにも11mg/L位のフェノールレッドが入っていると思います。 この試薬が入っていれば、培地の色は黄色〜赤になります。 この濃度であれば、色に気づかないということは無いはずです。 >> 無血清培地では黄色のままだったということですよね。 >説明がわかりにくくて申し訳ありません。 >血清培地はその通りでしたが、無血清培地では終始透明だったんです。 黄色のままではなく、終始透明だったのですよね。 黄色でも赤でもない時点でおかしいと思いませんか？

(無題) 削除/引用 No.690-11 - 2009/06/18 (木) 21:03:39 - wine > >血清培地はその通りでしたが、無血清培地では終始透明だったんです > その無血清培地は何ですか？ > はじめが無色ということはMEMではない培地ですよね。 > 透明とピンクということは、フェノールレッドではないpH指示薬が入っているのでしょうか？ > なぜ、ピンク色になったらアルカリになると分かるのですか？ > （フェノールフタレインだとpHが8以上になってしまう？） 使用した粉末培地は両方ともＭＥＭ培地です。違いは血清添加の有無だけなんです。私もさっぱり原因がわからなくて困り果ててしまいました。ピンク色がアルカリ性なのはフェノールレッドの性質・重炭酸ナトリウムが塩基性であるからと他の質問トピックにあがっており、そのように書きました。フェノールレッドがpH 6.8〜8.2で変色し、酸性〜中性では黄色、アルカリ性で赤という性質からだと素直に納得してしまったのですが、なにか間違いがあるのでしょうか。 > >その沈殿を培地に溶解したのですが > 細胞を生かしたままばらばらにする操作であれば、懸濁の方が通じやすいと思います。 > 溶解では細胞をlysisさせてしまうと受け取られる場合があります。 分解だと思われてしまうんですね！貴重なご意見どうもありがとうございます。今後十分に気をつけたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.690-10 - 2009/06/18 (木) 20:20:00 - ~ >血清培地はその通りでしたが、無血清培地では終始透明だったんです その無血清培地は何ですか？ はじめが無色ということはMEMではない培地ですよね。 透明とピンクということは、フェノールレッドではないpH指示薬が入っているのでしょうか？ なぜ、ピンク色になったらアルカリになると分かるのですか？ （フェノールフタレインだとpHが8以上になってしまう？） 思いつく範囲では、グルタミンと重炭酸ナトリウムの入れる順番でそこまで違いが生じる無血清培地はありません。 どちらかというと市販の無血清培地では重炭酸ナトリウムを先に入れることが多いと思います。 特殊な培地であれば、名前を出せば分かる人が出てくるかもしれません。 >その沈殿を培地に溶解したのですが 細胞を生かしたままばらばらにする操作であれば、懸濁の方が通じやすいと思います。 溶解では細胞をlysisさせてしまうと受け取られる場合があります。

(無題) 削除/引用 No.690-9 - 2009/06/18 (木) 19:18:14 - wine > それぞれの色合いが分からないのですが。 > 血清培地では重炭酸ナトリウムを入れたらピンク~オレンジになり、 > 無血清培地では黄色のままだったということですよね。 説明がわかりにくくて申し訳ありません。 血清培地はその通りでしたが、無血清培地では終始透明だったんです。 > 無血清培地の操作では、重炭酸ナトリウムとグルタミンを間違えて、グルタミンを2回入れているような気がします。 これは絶対にありえません。班に渡されたグルタミンはマイクロチューブ１本のみでした。 > 血清培地では、本当にグルタミンを入れたときに色が変わらなかったのですか？ 血清培地ではなく、無血清培地です。 > >沈殿を十分に溶解できていなかった > これはなんですか？何らかの試薬ですか？ 細胞を培地に融解し、遠心分離をかけました。その沈殿を培地に溶解したのですが、そのことを書きました。

(無題) 削除/引用 No.690-8 - 2009/06/18 (木) 19:13:34 - wine >Phenol redは酸性側では黄色です。 そのようですね。色の変化は粉末培地内にあらかじめ含まれているPhenol redが影響しているのは調べました。 > あともうひとつ。P3X63Ag8って、無血清D-MEMでは生きられないと思うのですが、ほかの班では大丈夫なのですか？ 血清培地に比べあまり細胞は増殖していなかったようです。今回の実験は血清と無血清培地の違いを考察させる狙いがあるのでしょう。 > 培地はP3X63Ag8ならＤ−MEMだとおもうのですが、DMEMはpHがいくつであれ、かなりピンク系の色があり、「透明のまま」という表現がちょっと気にかかります。ほかの血清入りの方の培地は班のものと比べて同じようないろですか？培地の造り間違い（D-MEM粉末のはかり間違い）があやしいような気がします。試しにほかの班の元気な細胞を分けてもらって、今の培地で買ってみてはどうでしょう。その逆も。 私も粉末の時点が一番怪しいと思っています。計り取ったのが自分ではないのでわからないのですが（その子は休みがちで確認が取れないのです。）、おそらく計り取るべき量よりも少なかったのでは･･･と踏んでいます。 １列ウェルが空いていたので、なさんがおっしゃったように他班から元気のいい細胞をもらって、問題の培地２種類で培養を始めてみました。今後経過を見ていこうと思います。 > > インキュベーター内で培養フラスコのフタをゆるめなかった > というのは「かもしれない」という可能性ですか？本当にゆるめてなかったら原因の一つであると思います。ただし、１日くらいならごまかせる程度なのではないかと思いますが、何日くらいそのような状態だったのでしょうか？ > > > 培養ピペットの火炎滅菌の時間が長く非常に熱い状態で細胞を採取してしまった > これもほんとうならアウトですが、細胞が生きているのなら直接の原因ではないでしょう。ピペットは焼いて滅菌するのが目的ではなく、ついているホコリをとばすくらいの意味合いなので、やり過ぎないよう気をつけてください。 フタはしっかりと閉めてしまいました。木曜日にフラスコ入れ、土日をはさんでプレートに分注するまでのだいたい５日間です。これも大きな原因の一つだと思っています。火炎滅菌も同様です。 今日は６５３細胞と同様の方法でHeLa細胞を培養したのですが、今までの反省を生かして十分に気をつけて操作を行ったところ、大変上手くいきました。６５３細胞があまりにも弱った状態で落ち込んでいたのですが、HeLa細胞のピカピカ光る元気な姿を見て本当に嬉しかったです。アドバイスをくださったなさんには本当に感謝しています。どうもありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.690-7 - 2009/06/18 (木) 11:23:44 - ~ それぞれの色合いが分からないのですが。 血清培地では重炭酸ナトリウムを入れたらピンク~オレンジになり、 無血清培地では黄色のままだったということですよね。 無血清培地の操作では、重炭酸ナトリウムとグルタミンを間違えて、グルタミンを2回入れているような気がします。 そうでなくとも、黄色のままでは培地が酸性ですので、死ぬ原因になるでしょう。 （そもそも無血清のMEMで培養できるのかが疑問ですが） 血清培地では、本当にグルタミンを入れたときに色が変わらなかったのですか？ グルタミンの変わりに重炭酸ナトリウムを2回入れていれば、グルタミン不足で細胞が弱ってもおかしくありません。 >沈殿を十分に溶解できていなかった これはなんですか？何らかの試薬ですか？ 試薬を十分に溶解させずに使えば、おかしい結果になっても不思議ではないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.690-6 - 2009/06/18 (木) 08:49:27 - な すいません。訂正です。 > DMEMはpHがいくつであれ、かなりピンク系の色があり うそです。Phenol redは酸性側では黄色です。おじさん(わたし)は実はもう十年以上(？）粉末から培地を作ってないんです。どうしてるのかというと、出来合のを買ってるのです。基礎を忘れてました。お恥ずかしい。

(無題) 削除/引用 No.690-5 - 2009/06/18 (木) 07:55:30 - な > 形態が正常時の綺麗な丸ではなく、ぼやけたような形になっているからです。 これはもう死んだ細胞かもしれませんね。。。 あともうひとつ。P3X63Ag8って、無血清D-MEMでは生きられないと思うのですが、ほかの班では大丈夫なのですか？

(無題) 削除/引用 No.690-4 - 2009/06/18 (木) 07:51:19 - な 培地はP3X63Ag8ならＤ−MEMだとおもうのですが、DMEMはpHがいくつであれ、かなりピンク系の色があり、「透明のまま」という表現がちょっと気にかかります。ほかの血清入りの方の培地は班のものと比べて同じようないろですか？培地の造り間違い（D-MEM粉末のはかり間違い）があやしいような気がします。試しにほかの班の元気な細胞を分けてもらって、今の培地で買ってみてはどうでしょう。その逆も。 また > インキュベーター内で培養フラスコのフタをゆるめなかった というのは「かもしれない」という可能性ですか？本当にゆるめてなかったら原因の一つであると思います。ただし、１日くらいならごまかせる程度なのではないかと思いますが、何日くらいそのような状態だったのでしょうか？ > 培養ピペットの火炎滅菌の時間が長く非常に熱い状態で細胞を採取してしまった これもほんとうならアウトですが、細胞が生きているのなら直接の原因ではないでしょう。ピペットは焼いて滅菌するのが目的ではなく、ついているホコリをとばすくらいの意味合いなので、やり過ぎないよう気をつけてください。

(無題) 削除/引用 No.690-3 - 2009/06/18 (木) 07:23:42 - wine ご回答どうもありがとうございます。 > 1) 細胞の調子が悪いのは血清培地、無血清培地、両方なのですか？ 両方です。 > 2) 弱っていると判断した理由はなんですか？　増えない、死細胞がおおい、形態が変、など。 培地内の細胞数が極端に少なく、形態が正常時の綺麗な丸ではなく、ぼやけたような形になっているからです。 > 3) ほかの班の細胞はどうなってます？ 顕微鏡の視野全体に綺麗な丸い形の細胞がぎっしりと確認できます。 > 4) ６５３細胞って聞いたことがないのですが、 マウスミエローマP3X63Ag8.653のことでしょうか？ 説明不足で申し訳ありません。はい、まさにその細胞です。

(無題) 削除/引用 No.690-2 - 2009/06/18 (木) 07:16:56 - な 入れる順番は関係ないと思います。ほかの班と違う色になったならば別の理由があるはず。 ところで、 1) 細胞の調子が悪いのは血清培地、無血清培地、両方なのですか？ 2) 弱っていると判断した理由はなんですか？　増えない、死細胞がおおい、形態が変、など。 3) ほかの班の細胞はどうなってます？ 4) ６５３細胞って聞いたことがないのですが、 マウスミエローマP3X63Ag8.653のことでしょうか？

細胞培養の際のＭＥＭ培地について 削除/引用 No.690-1 - 2009/06/18 (木) 06:59:45 - wine 今学校で６５３細胞の細胞培養を行っています。細胞を確認したところとても弱っていて、なぜこうなったのか原因を考えています。 培養ピペットの火炎滅菌の時間が長く非常に熱い状態で細胞を採取してしまった、インキュベーター内で培養フラスコのフタをゆるめなかった、インキュベーター外での放置時間が長かった、沈殿を十分に溶解できていなかった・・・などさまざまな原因が考えられるのですが、一つどうしても気になることがあるので質問させてください。 今回の実験では、ウシ新生児血清（ＮＣＳ）入りのＭＥＭ培地と無血清培地の２種類の培地を作製しました。 血清培地にはＮＣＳ→グルタミン→重炭酸ナトリウム溶液の順で添加すると、重炭酸ナトリウムを入れると色が変化しました。 ところが無血清培地には重炭酸ナトリウム溶液→グルタミン、と重炭酸ナトリウムを最後に入れずに先に入れたところ、その他同様の実験を行った班と異なり（ピンク色に変化（アルカリ））、培地の色は変化せず透明のままでした。 これはなぜなのでしょうか。入れる順番には何か意味があるのでしょうか。 これが直接的とは言えなくともなんらかの影響を与えているかもしれないので、どなたか教えてください。よろしくお願いします。

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