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(無題) 削除/引用 No.688-13 - 2009/06/23 (火) 13:33:22 - 苦労人 衝撃的ですね、今までRNaseを押さえようとしてきたRNA研究業界の苦労はなんだったんだろうかという気がしてきました。コロンブスの卵で、このpatentに書いてあるとおり、理屈ですね。これで押さえられるなら、RNAの仕事はずっと簡単になります。しかもDTTで良いので、超安いですし。逆転写やin vitro tranlationのときなどに、DTTをくわえるんで、RNaseInを入れる必要はないということですか。昔は、牛の胎盤をもらいに行って精製してた人もいたくらいでしたが。そこまでしなくても、DEPC処理をやりまくって、RNA専用ベンチなどをつくって、それは苦労してRNAの実験をやってたものです。最近では、そうでもなくなってきてはいましたけど。反応機構なんて、大昔からわかっていたので、それを考えればわかったはずなのに、どっと疲れが出てきました。 20mMくらいの濃度になるとDTTはかなり安定になって、4℃でほっといても、あまり酸化されなくなるようですよ。低濃度（<1mM)では確かに酸化されやすいですが。

(無題) 削除/引用 No.688-12 - 2009/06/23 (火) 10:22:13 - Pumpkin 私も検索してきました。中身としては、20 mM DTT-1 mM sodium citrate (pH 6.4)ですかね。b-MEなんかもRNase阻害能を持ちますので、DTTもあってしかりとは思いますが加熱するところがミソでしょうか。HOT SDS法なんかでRNAを取るときには65℃で加熱しますし、熱を加えるというのも割とtraditionalですよね。 ただ、DTTなんかへたって行く気がしますが、再加熱でRNaseを再ダウンとは何回までいけるのでしょうか、気になります。他にも色々入っているのかな（まだ、さらっとしか公報を読んでいずすみません）。 あ、cysteineも入っているみたいですね。これは、ロシアの受託会社が推奨しているRNA抽出メソッドにも出ていました。ただ、多糖の分離に有効みたいな感じっだたきがします（うろ覚えです）。

脱線だーいすき！DTT 削除/引用 No.688-11 - 2009/06/23 (火) 01:41:43 - 笑い男 　RTの酵素などを販売しているメーカー（実際に購入したメーカー）で 内部標準用のプライマーを販売していると思います。 　市販のプライマーといのは使用実績の高いtargetの指標になるでしょう。 最近はデータベースが充実しているので、目的の組織（その細胞）で恒常的に発現している遺伝子の当りをつけることがwebで可能になってきていると思います。あとは論文でよく使われている遺伝子をピックアップしておくことでしょうか。実験にあたって参考文献を集めておられるでしょうし、（以下省略）。個人的にはGAPDHが1st lineであとアクチンぐらいでなんとかなっています（RTそんなにしていないので、幸いにも何とか乗り切れてます）。 本題と違うところで話を進めて申し訳ありません United State Patent 6,777,210 これでしょうか？ 　RNAsecure Reagent使用経験のある方、もしよろしければ試薬の臭いを教えていただけませんか？

(無題) 削除/引用 No.688-10 - 2009/06/22 (月) 08:06:54 - Pumpkin 笑い男さん、 あ、いや、笑い男さんへのレスは、RNAsecure Reagentについてで、内部標準遺伝子についてはmasaさんにレス就けたつもりでした(笑い男さんは分かってらっしゃるのでGAPDHなどでもはかるべきだと発言したとの意図とくんでおります）。分かりにくい書き方をしてしまってすみません。 Masaさん、 ちょっとわからないのですが、RNA抽出してcDNA合成されて、収量？かQPCRでアクチンmRNA量を見られているのですよね？で、みなさんからの指摘のある電気泳動は行っているのですか？文脈からはしているように見て取れませんが、RNaseによる分解を指摘するのには電気泳動がまず始めに思いますが。内部標準がぶれるから、RNAが分解されていると考える人はダレもいないと思いますが。いかがですか？ 私はマンマルを扱っていませんが、tubline, GAPDH, actinのほかにアレイの結果から恒常的に発現している2-3種の内部標準遺伝子を使っています（毎回毎回全部をしているわけではありません）。過去レスに内部標準に関する議論がありますので検索してください。Pubmedには比較的最近まとまった論文があると思いますので検索してください。

(無題) 削除/引用 No.688-9 - 2009/06/22 (月) 02:28:07 - masa 皆様、いろいろなご意見ありがとうございます。 まず、私の使っているサンプルについてですが、動物から取ってきた物を直接ＴＲＩＺＯＬにいれてホモジネートしていました。取ってくる際に周囲の組織をなるべくどけていますがどうしても細胞浮遊液に挫滅した組織の一部が混入するためナイロンメッシュにて除去後、遠心分離にて欲しい細胞を取っていました。いま考えるとRNAlaterで保存しておけばRNaseの心配は少なかったのかもしれません。実際は、ｃＤＮＡのできなかったサンプルのうち半分は、DNase１の反応をしないでＲＴをやってゲノムのコンタミのない十分なcDNAが取れました。（私の勝手な予想では、RNase inhibitorが無い状態での３７℃の反応をしなかったため採れたのかと思ってます。） しかし、残りの物はＴＲＩＺＯＬで再抽出し、ＲＴしましたが、うまくできませんでした。 この結果を踏まえて考えてみると、動物から細胞を採る際の細胞ストレスは十分に考えられるサンプルでした。（遠心分離がうまくいかずやりなおしたサンプルだったり、ヘパリンの濃度を間違えたサンプルだったり） 時間はかかりましたが、解決の方法も少しつかめたような気がします。 今度は、Trizol前の細胞の状態も十分に考慮してサンプル取りしてみようと思います。 ところで、話から少しそれるかもしれませんが、ハウスキーピングジーンはどういった物をお使いでしょうか？私が扱う動物は、薬剤の長期投与による影響を調べています。こういったストレス下においても発現の安定している物はありますでしょうか？現在、アクチンを使っていますが、他にもっといい物があればと思い、皆様のご意見をうかがえればと思います。宜しくお願いします。

RNAsecure Reagent 削除/引用 No.688-8 - 2009/06/21 (日) 23:19:15 - 笑い男 　Pumpkin様のご指摘のとおり、いつでもどこでも一定の 内部標準なんてありゃしない！というのが過去ログにも 議論されていますので、私の意見を一部訂正いたします。 　言いたかったことは、RNaseのコンタミが原因なら、 確かめようもあるし、対処もやりようがある。 　むしろ個人的にはTrizol前のサンプル調整法に 原因があるように思えるので、意識をそこにも向けて ほしいなー　ということです。 　RNAsecure Reagentが気になって気になって・・・ ややmasaさんへのコメントが甘かったことをお詫びいたします。 　気になって気になって気になって気になって 中身はいったい何なのか？なぜ再加温で不活効果が戻るのか？

RNAsecure Reagent 削除/引用 No.688-7 - 2009/06/21 (日) 21:04:22 - Pumpkin 笑い男さん、 既に指摘があり、過去ログにも内部標準遺伝子についての議論がありますので、単一の遺伝子を持ってしてあれこれ考えるのは危険に思います。 レスからちょっとずれますけど。私もRNAsecure Reagentの中身と作用機序は前からずーと気になっているんですよね。新たなRNaseコンタミに対処できるばかりか、ダウンストリームの実験に影響ないとすら。RNAlaterは中身が公表されているから自作もできますけど、これはちょっとわからないですね。特許公表を探ってみようかな。 25×ということですが、値段的にはばかばか使えるものではないですね。非常に重要なサンプルとかだったら使ってみる価値はあるのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.688-6 - 2009/06/20 (土) 19:20:11 - 笑い男 >[Re:1] masaさんは書きました : > 最近、動物から取ってきた細胞を用いて・・・ > 今まではRNAlaterにて保存していた組織を使ってTRIZOLで・・・ >DNase1にて反応させた後ＲＴしていました。・・・ 　フィーリング的にはRNaseのコンタミが原因では無いように 感じています。 　組織の実験をしていた時と同じ(メーカー、商品番号、(ロット)） DNase１で処理しているのであれば、DNase1に起因している可能性は 無いとして・・・ 　プライマリーの細胞でしょうか？組織ごとサンプルにするのでは 無く、組織を取ってきて細胞にまでバラバラにして、目的の細胞群を 回収して、そこで直ぐにTrizolですか？少し培養してからTrizol？ 　培養細胞の方が組織からRNA精製するよりトラブルが少ないので、 細胞を使ってコンタミしましたというのは、手技の問題なのか/動物から とってきた細胞？なのか（APさんの意見を含め）と推察しています。 　GAPDHとか使ったらバラつきが無くなった〜なんてどうかしら？ 　Trizolのクロロホルム後の上清をスピンカラムの精製キットで精製？ 　個人的な本題はここからで、RNAlaterって硫安・EDTAと言われていますが すごいですよね。値段も高いが効果も高い。 　っで　　http://www.ambion.com/jp/catalog/CatNum.php?AM7005 これは何でしょうか？DEPCに変わるRNase不活剤みたいですが、 トリスとかでも使用できて、再加温すれば不活作用が復活するって！ 中身に心当たりがあるかた居られませんか？

(無題) 削除/引用 No.688-5 - 2009/06/18 (木) 13:08:17 - AP ほんとうに分解のせいかどうか、DNaseの問題かどうか、検証しないで決めつけているように読めますけれど。なにか合理的な根拠はおありでしょうか？ 気になったのは、今までうまくいっっていたというのが「組織」で、うまくいっていないのが「細胞」というところです。細胞って組織より（そしきだってそうですが）環境の違いややストレス応答で遺伝子発現ががらっとかわってしまうことがありますよね。アクチンなんてストレスに反応しやすい類ではないですか？

(無題) 削除/引用 No.688-4 - 2009/06/18 (木) 09:40:16 - おお >[Re:3] masaさんは書きました : > おお　様　早速のご返答ありがとうございました。 > サンプルは保存前に十分ホモジナイズしているのでＯＫだと思います。 > あと、追加の質問なのですが、1%SDSとか、フォルムアミドなどで溶かしたものをそのままＲＴの反応に使うことはできるのですか？それとも一度溶かしてRNaseを失活させた後に再精製してTEやＤＥＰＣ水に溶かすのですか？ > 何度もすいませんが宜しくお願いします。 フォルムアミドで溶解したものはRTPCRに使えるという話はあります。 でも幾らか抑制がかかるような話もあるようです。 これは私もここで話を聞きました、過去ログにあると思います。

(無題) 削除/引用 No.688-3 - 2009/06/18 (木) 07:55:14 - masa おお　様　早速のご返答ありがとうございました。 サンプルは保存前に十分ホモジナイズしているのでＯＫだと思います。 あと、追加の質問なのですが、1%SDSとか、フォルムアミドなどで溶かしたものをそのままＲＴの反応に使うことはできるのですか？それとも一度溶かしてRNaseを失活させた後に再精製してTEやＤＥＰＣ水に溶かすのですか？ 何度もすいませんが宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.688-2 - 2009/06/18 (木) 04:33:08 - おお まずはRNAが分解しているかリボソーマルRNAを検出して確認される方が いいかと思います(分解の可能性は高いですが、そうでないのに RNaseをターゲットにした対処方法をするのは無駄になりますので)。 TRIZOLでイソプロで沈殿、洗ったあとRNaseの活性が発揮できない ような溶液で溶解して再精製すると、RNaseのアタックをさけて、 RNaseを除去できます。 1%SDSとか、フォルムアミドなどで溶かせばいいかと思います。 その後さらにTRIZOLでもう一度精製するとか、フェノール、クロロフォルム で精製するとか、たのキットを使うとかいろいろ選択肢はあるとおもいます。 ちょっとちゃんと目を通さなかったのですが、精製前の保存には 問題ないとお考えですか? トライゾールで細胞を溶解したとき、ニードル,ホモジナイザー などを使って均一にしておかないと、保存中に悪くなることがあります。

RNaseの不活化 削除/引用 No.688-1 - 2009/06/18 (木) 04:14:46 - masa 最近、動物から取ってきた細胞を用いてＲＴ−ＰＣＲをやってみたのですがどうもRNaseがコンタミしている可能性が高く何かいい方法はないかとおもいスレを立てました。 今まではRNAlaterにて保存していた組織を使ってTRIZOLでtotalRNAを取ってきてその後ゲノムのコンタミをつぶすためDNase1にて反応させた後ＲＴしていました。この方法では特に大きな問題は無くできましたが、今回は動物から取ってきた細胞をＰＢＳで洗浄後、直接TRIZOLをいれて保存していました。RNAの濃度や純度はいつも通り取れてそうなのですが、このサンプルでDNase後RTするとβactinがかなりばらつき困ってます。total RNA溶液内のRNaseをRNase inhibitorなどでつぶすことは可能でしょうか？いい方法があるようでしたらご教示いただけないでしょうか？

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