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(無題) 削除/引用 No.684-7 - 2009/06/19 (金) 19:25:53 - ぽー タンデムリピート領域をPCRする目的はなんなんでしょうか？ それによってPCRベースにするのか他の方法にしてもいいのかが変わってくるので・・・

(無題) 削除/引用 No.684-6 - 2009/06/19 (金) 18:33:36 - SYBR_master >[Re:1] tdsm1さんは書きました : > 目的の配列は、数十bpの配列が十数回タンデムにつながっています。約2kb > です。この配列の直前と直後にプライマーを設計しました。 tandem、invarted、simple repeat など repetitive sequenceでかつ複数回のrepeatのPCRは。1-2回やってみて駄目ならさっさと諦めるタイプの実験です。続けるだけ（精神的な安寧の為にも）無駄です。上手くいってもPCRが動いても、repeatが十数回のものはOriginalとAmpliconでは回数が異なる可能性が大きいので、PCRを選択しないのが無難です。 genome sequenceを行ったことがある人なら常識レベル（常識ってなんどろうと思わないでもない）の知識ですが、分野が違うと以外に知られていないことも知っていますので、まあしょうがないでしょ。理由はあちらこちらに書かれていますし、paperもあると思いますので調べてみてください。個人的には「増えない理由についての知識」を増やしてもあまり「建設的」ではないとも思いますが、理由を知らない教官等に説明する場合、「屁理屈をこねている」と思われないためには理論武装も必要かと思います。 で、これだと増えないので何かしら手を差し伸べなければいけないのですがいけないのですが、ヒントだけ。Rolling circle amplification（ＲＣＡ）ならrepeat回数もoriginalと同じで増えますが、鋳型(template)を環状にしなければなりません。どうやったらいいかは調べてください。結構paper出ていますし、やり方は複数あります。

(無題) 削除/引用 No.684-5 - 2009/06/18 (木) 00:02:44 - Tb ~さんがかかれておられるPhusionでうまくいったことがあります。 私の場合も転写因子のresponsive elementがtandemにつながっているレポーターベクターからその部分をPCRでとりだせました。これがPfusionという酵素のおかげなのか、それともPhusionの推奨条件、98℃での変性、および長めのプライマーで高温でアニーリングする、ということによるものなのかよくわかりませんが。 ちなみに、PCR・クローニング後のシークエンスは、どちらの方向から読んでもこのタンデム配列のところでぴたっと止まってしまって、結局読めませんでした。でもシークエンスについては近くのトビにshRNAベクターについてありましたから私も参考にさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.684-3 - 2009/06/17 (水) 22:15:07 - AP >現在、繰り返し配列に対するPCRを行っているのですが、うまくいっていません。 どううまくいっていないのかを説明願いえませんか。 スメアやラダーになるのか、増えないのか、あるいは他の問題か。 ダイレクトリピートの場合なにがおこりそうかはなんとなく想像がつきますが（難しいと思います、、、、）

(無題) 削除/引用 No.684-2 - 2009/06/17 (水) 21:58:50 - ~ タンデムの配列は試したことがありませんが、 shRNA発現ベクターのヘアピン配列を増やした際には、Phusionで増やすことができました。 LA taqや普通のtaqでは増えないヘアピン配列も増幅できましたので、 高次構造に強い酵素（またはバッファー？）なのだと思います。

繰り返し配列のPCR 削除/引用 No.684-1 - 2009/06/17 (水) 21:19:21 - tdsm1 現在、繰り返し配列に対するPCRを行っているのですが、うまくいっていません。 目的の配列は、数十bpの配列が十数回タンデムにつながっています。約2kb です。この配列の直前と直後にプライマーを設計しました。 Long PCRでもうまくかかりません。現在条件検討を行っているところなのですが、いい条件をご存じの方がおられましたら、ご指導いただきたいです。

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