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(無題) 削除/引用 No.682-13 - 2009/06/19 (金) 11:36:11 - おお >[Re:12] mmさんは書きました : > PDVFでの経験があります。親水化しないで、適量のメタノールをメンブレンの上に直接たらし、すぐにサンプルをたらせばメタノールが乾くとともにサンプルが吸着されました。たとえば、10ulのメタノールを垂らした後に同量のサンプルを垂らすように。。 お、これはすごいいいアイデアだ、、、 今回載せるのは比較的短いペプチドというのもあって、 保持能力の強いPVDFを使うかどうか悩んでたんです。 ちょっとほかのわけもありまして今回先ずはニトロセルロース でやってみます。 でも参考になりました。 >[Re:11] Aさんは書きました : > > おおさんの場合は少量のようなので問題ないと思いますが、少量 > のせると検出できるのに多めにのせるとシグナルが検出できなく > なるという経験をしたことがあります。 多いシグナルが弱くなるですか、、、そういう時は 条件を決めるのが問題になってきますね。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.682-12 - 2009/06/18 (木) 22:25:56 - mm PDVFでの経験があります。親水化しないで、適量のメタノールをメンブレンの上に直接たらし、すぐにサンプルをたらせばメタノールが乾くとともにサンプルが吸着されました。たとえば、10ulのメタノールを垂らした後に同量のサンプルを垂らすように。。

(無題) 削除/引用 No.682-11 - 2009/06/18 (木) 16:06:04 - A 私も何度か経験があります。 ニトロセルロースで濾紙の上にメンブレンをのせてやってました。 膜を乾燥させた後、WBのブロッキング以降の処理をしていました。 おおさんの場合は少量のようなので問題ないと思いますが、少量 のせると検出できるのに多めにのせるとシグナルが検出できなく なるという経験をしたことがあります。確か大腸菌のホール ライセートだったと思います。当然といえば当然ですが膜の 許容量オーバーしたために起こったのでしょう。ですからもし 多量のコンタミ蛋白質が含まれているサンプルをドットブロット する場合には数ポイント振ったほうが良いようです。

(無題) 削除/引用 No.682-10 - 2009/06/18 (木) 04:09:13 - おお >[Re:9] youmeiさんは書きました : > PVDFを親水化した後に、濡らした厚めの濾紙の上に置いてやると良い感じです。 > やはり下から吸い取るようにする方がいいのですね。 因みにみなさんはドットブロットでタンパクの固定は乾燥で 吸着させているのでしょうか? ウエスタンではメタノールをトランスファーバッファー に加えることで固定を増強させてます(SDSの効果をつぶす 意味もあると思いますが、、)。

(無題) 削除/引用 No.682-9 - 2009/06/17 (水) 22:00:19 - youmei PVDFを親水化した後に、濡らした厚めの濾紙の上に置いてやると良い感じです。

(無題) 削除/引用 No.682-8 - 2009/06/17 (水) 18:01:47 - 中年 PVDFはDMSOに耐性です。うちで使ってるPallのPVDF膜のカタログにもそのようにあります。 http://www.pall.com/variants/jpn/pdf/JA_Lab_DS_20022_FluoroTrans_PVDF_Transfer_Membranes.pdf DMSOに溶けたペプチドを吸着できるかどうかは知りません。

(無題) 削除/引用 No.682-7 - 2009/06/17 (水) 16:49:58 - さく PVDFでやろうとした経験が有ります。 結論は、おとなしくニトロセルロース、です。 中年さんのご想像の通り、親水化する時点で メンブレンが濡れてしまうのでサンプルが流れてしまったり、 メンブレンの下にキムタオルを置いて少しマシになりましたが、 うっかりするとキムタオルがメンブレンの水分を全部？吸ってしまって タンパク質溶液が乗りにくくなってしまったりしました。 また、おおさんのご想像のとおり、これは私が下手なだけかもしれませんが スポット円の大きさが変わってしまってました。 メンブレンに急速に吸い込まれる（広がる前に吸われる）か、 ゆっくり吸い込まれるかの違いだと思います。 少し凸凹のあるキムタオルなんかを下に置いた場合は割と顕著です。 私の場合、ウェスタンの条件検討の一環としてのドットブロットで 光れば良いという感じでしたので、円の大きさが変わっても そのままでやってました。 あまりお役に立てず申し訳ないですが、ご参考までに。

(無題) 削除/引用 No.682-6 - 2009/06/17 (水) 16:37:51 - おお >[Re:5] 中年さんは書きました : > 私がやった時はニトロセルロースを使いました。乾いたまま使ったので真ん中が抜けるような吸着パターンになったのかもしれません。PVDFだとウェッティングのせいでサンプルが広がってしまうかもしれませんね。 あ、そうですね。 > あまりお役に立たない情報ですみません。 いえいえ大変参考になっています。 あ、どなたかこういう膜がDMSO耐性かどうか知ってる人 いますかねぇ、、、、DMSOに入ったサンプルもあるんです実は。 ぐぐってみるか、、、

(無題) 削除/引用 No.682-5 - 2009/06/17 (水) 16:02:53 - 中年 私がやった時はニトロセルロースを使いました。乾いたまま使ったので真ん中が抜けるような吸着パターンになったのかもしれません。PVDFだとウェッティングのせいでサンプルが広がってしまうかもしれませんね。 あまりお役に立たない情報ですみません。

(無題) 削除/引用 No.682-4 - 2009/06/17 (水) 15:40:23 - おお >[Re:3] 中年さんは書きました : > 追加と訂正です。 > > 何の問題も無いは言い過ぎでした。昔の記録を調べてみたら、染み込むときにサンプルが周辺に押しやられたせいか、中央の抜けたドーナツ型の染色パターンになっていました。定量性が問題になるような場合には膜の下に適切な吸収材を置くような工夫が必要かもしれません。吸引して膜面に対して垂直の流れを作った場合にはこのようなことは起こらないでしょうから、装置があればその方が良いと思います。 ありがとうございました。 吸着のとき、サンプルが広がってコントロールしにくいかなあとか 考えてました。量が装置を使うまでもないけどそれなりにある時は 下に吸い取れるものを置く方がたしかにいいかもしれませんね。 膜はPVDFでしょうか、ニトロセルロースでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.682-3 - 2009/06/17 (水) 15:26:12 - 中年 追加と訂正です。 何の問題も無いは言い過ぎでした。昔の記録を調べてみたら、染み込むときにサンプルが周辺に押しやられたせいか、中央の抜けたドーナツ型の染色パターンになっていました。定量性が問題になるような場合には膜の下に適切な吸収材を置くような工夫が必要かもしれません。吸引して膜面に対して垂直の流れを作った場合にはこのようなことは起こらないでしょうから、装置があればその方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.682-2 - 2009/06/17 (水) 15:13:44 - 中年 経験有ります。何の問題もありません。 吸引はサンプルの容量に対して狭い面積にタンパク質を吸着させるための手段に過ぎないので、今回のようにサンプルが数ul程度であればその必要はありません。

手ぬきドットブロット 削除/引用 No.682-1 - 2009/06/17 (水) 14:56:29 - おお ドットブロット用のサンプルを乗せて、吸引したりして サンプルを吸着させる装置がありますが、 サンプルが数ul程度で十分な時、そういう装置を使わずに 膜にドロップして吸着させて、抗体でタンパクを検出された 方いますか? もしご経験がありましたら、経験からの注意展とか アドバイスが聞きたいと思っています。

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