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FISHでのハイブリダイゼーション トピック削除
No.677-TOPIC - 2009/06/17 (水) 03:43:29 - jikkenn+ganbaruzo
FISHでのハイブリダイゼーションのstepでの質問です。
ハイブリダイゼーションさせるprobeは、2本鎖なので、使用前に、例えば90度で変成させると理解していました。ポセイドンのプローべは、このstepがあります。しかし、Vysisのprobeには、このstepが、ありません。これは、Vysisのプローべが１本鎖ということですか?また、ポセイドンのプロトコールでも、サンプルとプローべの変生を同時にするのと、別々に変成させるプロトコールがあります。素人的に考えると、別々に変成してから、ハイブリダイゼーションさせる方が効率が良いと思うのですが,,,どちらの方が、良いプロトコールなのでしょうか?
基本的な事ですが、御教授下さい。
　
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ありがとうございます。 解決済み 削除/引用
No.677-7 - 2009/06/20 (土) 05:10:53 - jikkenn+ganbaruzo
ありがとうございます。
in situさんの提案に沿って、再実験してみます。
ちなみに、ポセイドンの会社のプローべは、反復配列を除去したもので、反復配列をブロッキングするCot-DNAは不要みたいです。また販売されている商品以外に、ＢACからDNAを取ってきて、ラベルして、ハイブリダイゼーションすることもやってみましたが、うまく行きませんでした。その時の、ハイブリダイゼーションバッファーの組成は、vysisのLSI/WCP® Hybridization Bufferを使用していたので、分かりません。
うまく行かない時は再度、その結果をふまえて質問させていただきます。
ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.677-6 - 2009/06/19 (金) 13:31:02 - AP
ことなる質問がフュージョンしているような感じですが、
1. そう読めるプロトコールがあるが、プローブの変性は必要ないのか？
常識的にいって必要です。掲載された、変性のステップが書かれていないプロトコールは、プローブがあらかじめ変性されたものであることが前提になっているのではないでしょうか。たとえば、プローブ標識のプロトコールの最後に変性するステップが含まれているとか。変性済みプローブを販売している会社でもありますし。

2. ノイズの問題は、また別のことですね。問題のキットは特定の遺伝子を検出することを前提にデザインされているのかもしれません（そういうプローブを販売している会社ですし）。BACをプローブにする場合、多様な配列が含まれ、そのなかには反復配列（ゲノムの中に多コピー含まれ、存在箇所も多様な）が含まれていると考えて置いた方がいいです（ちなみに反復配列はセントロメアやヘテロクロマチン領域にはクラスターになっていることが多いです）。ご使用のキットがユニークなプローブを使用することを前提にしているとしたら、反復配列を含むプローブに適用するときはモディファイする必要があるかもしれません。

一般的に、BACをプローブにする場合は、ハイブリバッファーに断片化したゲノムDNAをキャリアとしていれて、反復配列をブロッキングしておくとか（反復配列はCot値が小さく、ユニーク配列より早くハイブリするので、優先的にブロックされる）、プローブから反復配列を除いておくとか、工夫が必要です。

(無題) 削除/引用
No.677-5 - 2009/06/19 (金) 10:37:32 - in situ
自分はRNAプローブを使ったRNAを検出するためのFISHをやっていましたので、直接比較できるかはわかりませんが、スレ主さんのプロトコルでバックグラウンドの原因となりそうなところとしては

１．ハイブリの温度と時間
　自分は42℃〜50℃くらいで2〜3日やっていました。最初のころover nightでやっていましたが、ここで助言していただき、プローブの濃度を若干薄くして2〜3日やるようになって非常にきれいに染まるようになりました。

２．ハイブリバッファーの組成
　既製品なので組成が分からないかもしれませんが、バックを低減させるために塩濃度を上げて長時間ハイブリが定石だそうです。（ロシュのテクニカルさん談）

３．wash
　washが少ない気がします。自分は50%ホルムアミド＋2XSSCで50℃20分×3、0.1XSSCで50℃20分×3でwashしていました。

(無題) 削除/引用
No.677-4 - 2009/06/19 (金) 00:27:41 - jikkenn+ganbaruzo
質問の仕方がまずく申し訳ありません。
どちらもDNAプローブです。プロトコール通りにやると、バックグラウンドが高く(セントロメアの分は良好ですが、ターゲットのバックグラウンドが高いです)、なかなかシグナルが観察できません。対象は、組織でなく、細胞です。血中の上皮癌細胞を磁気ビーズで、とってから、FISHをしています。
どこから改良していくかなのですが、、、
ポセイドンはリンク先があるのですが、Vysisの分はないので、プロトコールを長くなりますが、張り付けます。

http://www.kreatech.com/LinkClick.aspx?fileticket=6wRhdxSVfno%3d&tabid=107&mid=475

Vysisのプロトコールはパラフィン組織ですが、業者の人に聞くと、同じでよいと言われました。

4.Fix with 3:1 ethanol to acetic acid solution at 4℃　for 10min
5.Wash slides, 2 x 10min with 2xSSC(pH 7.4) at RT.
6.Put slides into protease solution(pH 2)(pepsin(2500-3000units/mg)25mg/0.01N HCl 50ml)at 37℃ for 10min (←This step can be skipped.).
7.Wash slides, 2 x 10min with 2xSSC(pH 7.4) at RT.
8.Dry up the slides.
9.Put slide into 10% Formalin Neutral Buffer Solution for 10min at RT
10.Wash slides, 2 x 5min with 2xSSC(pH 7.4) at RT.
11.Dry up the slides.
12.Mark the point of the cells on the back side of the slide with the diamond pen.
13.Put slides into the degenerating buffer(70% Formamide/2xSSC pH7.0~8.0) at 73℃
for 5min in water bath.
14.Put slides into 70% ethanol with gentle shaking for 1min. Repeat with 85% ethanol. Repeat with 100% ethanol.
15.Dry up the slides on warmer at 45~50℃
16.Add 10ul of probe mixture (Vysis Hybridization buffer 7ul,target probe 1ul,control probe 1ul,DDW 1ul) onto slide.
17.Place cover slip on slide.
18.Seal the edges of the cover slip with paper bond.
19.Hybridize at 37ºC overnight in a wet box shielded from the light.
20.Remove cover slip by placing slides in posthybridaization buffer (2xSSC/0.3% NP-40 pH 7.0~7.5)
21.Take out the slides and gently remove the cover slip. Put slides in the posthybridaization buffer (2xSSC/0.3% NP-40 pH 7.0~7.5) at 73℃　for 2min in water bath.
22.Dry up the slides in the dark.
23.Add 5ul antifade mounting solution with DAPI.
24.Place cover slip on slide.
25.Seal with nail polish.
26.Store at 4ºC in the dark.

(無題) 削除/引用
No.677-3 - 2009/06/18 (木) 18:23:35 - in situ
自分はRNAプローブを使ってFISHをしていましたが、当然一本鎖です。
変性ステップはサンプルとプローブ別々に行っていました。

挙げておられる二つの会社の製品がどのようなものかわかりませんが、片方だけRNAプローブっていうことはありませんか？

スレ主さんの質問は、前回のスレも含めて、個人的な上、詳細なプロトコールがないため、何が問題になっているのかわかりません。

既製品を使われているのでしたら、一度そのマニュアルに沿って実験してみてから、実際に起こった問題点に関してマニュアルと共にここで相談するとsuggestionが得やすいと思います。

最初から最良のプロトコールを得たいと気持はわからなくもないですが、サンプルが変われば良い方法も変わってきますから。

頑張ってください。

(無題) 削除/引用
No.677-2 - 2009/06/18 (木) 18:09:26 - AP
いきなり商品名（しかもメジャーとは言えない）で話をされてもなあ。せめて各製品のプロトコールへのリンクでもないとコメントしようがないです。

>Vysisのprobeには、このstepが、ありません。これは、Vysisのプローべが１本鎖ということですか?

FISHのために一本鎖プローブを調製するということはまずないと言っていいでしょう（労力やコストの割にメリットなし）。
可能性のひとつは、変性済みプローブが含まれたキット（カタログだけざっとみると、あるみたいですね）のプロトコールをみているから。
あるいは、染色体標本にアプライしてから、染色体DNAと同時に変性するプロトコールだから。この方法もFISHでは一般的です。


>サンプルとプローべの変生を同時にするのと、別々に変成させるプロトコールがあります。素人的に考えると、別々に変成してから、ハイブリダイゼーションさせる方が効率が良いと思うのですが,,,どちらの方が、良いプロトコールなのでしょうか?

効率が良いと考える根拠は？ただのフィーリング？
どっちの方法もありで、どちらの方法のプロトコールもあります。
好みとの問題と、自分の手、実験設備などでやってみてうまくいけばどちらでも。
論文やマニュアル本など見る限りの私見では、FISHに限っては標本にプローブをかけて同時に変性する方がむしろ一般的なように思います。染色体標本を形態やバンドを損なわないように変性し、かつ変性状態を保っておくのは難しいので、プローブとコンタクトした状態で変性し、ただちにハイブリの条件になるようにした方がいいんじゃないかと。

FISHでのハイブリダイゼーション 削除/引用
No.677-1 - 2009/06/17 (水) 03:43:29 - jikkenn+ganbaruzo
FISHでのハイブリダイゼーションのstepでの質問です。
ハイブリダイゼーションさせるprobeは、2本鎖なので、使用前に、例えば90度で変成させると理解していました。ポセイドンのプローべは、このstepがあります。しかし、Vysisのprobeには、このstepが、ありません。これは、Vysisのプローべが１本鎖ということですか?また、ポセイドンのプロトコールでも、サンプルとプローべの変生を同時にするのと、別々に変成させるプロトコールがあります。素人的に考えると、別々に変成してから、ハイブリダイゼーションさせる方が効率が良いと思うのですが,,,どちらの方が、良いプロトコールなのでしょうか?
基本的な事ですが、御教授下さい。
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