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(無題) 削除/引用 No.675-6 - 2009/06/20 (土) 01:04:21 - AP それと、まず固定液を変えてみますね。PLP固定液は糖鎖も架橋固定するので処理中に膜タンパク質が失われることが起こりにくいようです。

(無題) 削除/引用 No.675-5 - 2009/06/20 (土) 00:48:49 - AP 膜にアンカーしているタンパク質だと、界面活性剤で膜がとろけると足場を失って抜けてしまう可能性はあります。TweenやTxを使っているなら濃度を下げてみるとか、よりマイルドなサポニンや胆汁酸を使うのは一般的に用いられる方法でしょう。

(無題) 削除/引用 No.675-4 - 2009/06/17 (水) 01:36:52 - CJ 細胞内の膜蛋白が洗剤処理でだめ、という経験はありません。ちょっと妙ですね…。抗体が大丈夫な確証はありますか？ 弱い洗剤、ということでしたら、Tritonの濃度を0.01％までおとす、とか、Tween20を使うとか、写真の現像後につかう水滴防止剤(photofloとかいったか？忘れました）などの手が考えられます。 もう１点の可能性として、固定がへぼかったら洗剤で標的分子が洗い流されてしまうでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.675-3 - 2009/06/17 (水) 00:28:15 - Wiz CJ様 > 結論は両方試してみる、ってところでしょうか。私は抗体の条件決定時に（洗剤あり/なし）という条件も振ることがあります。同時に並行してやれば大して手間でもありませんし。 申し訳ありません。書き忘れていました。 洗剤（Triton）無しではうまくいかなかったのです。今回用いた抗体は細胞内部分を認識するものなので、おそらく、ある程度は穴を開けて浸透させやすくする必要があると思っています。 たとえばdetergent作用の異なる洗剤（もっとマイルドなもの等）を用いるとシグナルが改善されるということはあるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.675-2 - 2009/06/16 (火) 23:06:31 - CJ 大いにありうることですが、膜蛋白だから洗剤はだめ、というわけではありません。例えばシナプス関連タンパクは狭いシナプス領域に極めて密にパックされているので、洗剤なしではなかなか染まらなかったりします。また、同じ膜蛋白でも小胞関連とかだと洗剤が入っているほうが良く染まります。 結論は両方試してみる、ってところでしょうか。私は抗体の条件決定時に（洗剤あり/なし）という条件も振ることがあります。同時に並行してやれば大して手間でもありませんし。

蛍光免疫染色と界面活性剤 削除/引用 No.675-1 - 2009/06/16 (火) 22:35:42 - Wiz いつもお世話になっています。 ちょっと疑問なのですが、マイクロスライサー等で作成した切片を、浮遊法で免疫染色する際に、界面活性剤をいれることがあると思います（TritonXが一般的でしょうか）。このstepなのですが、標的タンパクが膜蛋白である場合、かえってシグナルを見にくくしてしまうことはあるのでしょうか。実際にご経験ある方などいらっしゃいましたらご教授お願いします。 現在、ある膜蛋白質の免染がうまくいかず上記のような可能性を考えました。 参考までに私が行った免染のプロトコールです。 4%PFA固定組織（30-100um） ↓ PBS wash ↓ Blocking（1% serum, 0.3% Triton-X）, 1hr ↓ 1st Ab, over 48hr at 4℃ （blocking buffer で希釈） ↓ PBS wash, 2nd Ab, mount 0.3%TritonX で 48hr 以上処理していることになります。

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