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(無題) 削除/引用 No.655-7 - 2009/06/16 (火) 05:01:34 - おお >[Re:6] 保証なしさんは書きました : > ＞でこれがノンスペでないことが確認できたとして、 > > これが前提ですので、 たしかに大前提ですし、どうやってそれを 吟味するか、というところで難しいところがあります。 ノンスペの捉え方にもよるとも思えますね。 > 単純に、IPしてバンドを切り出し、マスです。私なら。もちろんIPで落ちてくるていうのは基本的前提事項です。 あまり考え過ぎなのかなという気もしてきました。 ただこのバンド本来の抗原が何かとSDS耐性の アグリゲーションをしているような気もしています。 サイズ的にホモダイマーの状態からアグリケーション した可能性もあるかもなというところです(予想より ちょっと小さいですが)。そうするとIPでほかのタンパク がマスで取れてきた場合、たのタンパクばかり見ていると 結果が出ないようなきがしています。

(無題) 削除/引用 No.655-6 - 2009/06/15 (月) 21:17:06 - 保証なし ＞でこれがノンスペでないことが確認できたとして、 これが前提ですので、単純に、IPしてバンドを切り出し、マスです。私なら。もちろんIPで落ちてくるていうのは基本的前提事項です。 多少コンタミしていてもマスからの情報なら、データ解析から何とかなることもあります。 抗体とかとのバンドと重なるなら、いろいろ工夫する必要があります、

(無題) 削除/引用 No.655-5 - 2009/06/15 (月) 15:32:23 - おお >[Re:4] 名無しさんは書きました : > そのサンプル以外の細胞や組織で同じような位置にエキストラバンドは出ませんか。比較的量に余裕のある手近な細胞や組織ライセートを集めてスクリーニングして、同様なものがでるものを見つけて、当座は量的に余裕のあるそうした別のサンプルでIPとかで精製してマスで同定してみたらどうでしょうか。蛋白質さえ同定できれば、その抗体を入手して、いまの貴重なサンプルの方でpull-downとかで検証してみればいいと思うので。 ありがとうございました。 実は細胞なんかでもそういう現象が見られる事は あります。今のところどんな条件で再現性よく得られるかなど 考えている最中です。 しかしながら、それが今あるある特殊な状態で得られた組織 の物と一緒の物を見ているのかという点で、慎重になっている のが現状です。 生化学的に思いつく角度からせめて行こうとはしている のですがまだ結論が出ていません。

(無題) 削除/引用 No.655-4 - 2009/06/15 (月) 13:05:29 - 名無し そのサンプル以外の細胞や組織で同じような位置にエキストラバンドは出ませんか。比較的量に余裕のある手近な細胞や組織ライセートを集めてスクリーニングして、同様なものがでるものを見つけて、当座は量的に余裕のあるそうした別のサンプルでIPとかで精製してマスで同定してみたらどうでしょうか。蛋白質さえ同定できれば、その抗体を入手して、いまの貴重なサンプルの方でpull-downとかで検証してみればいいと思うので。

(無題) 削除/引用 No.655-3 - 2009/06/15 (月) 10:05:37 - おお >[Re:2] お世話サマーさんは書きました : ありがとうございます。 > その抗体は、エキストラバンドのタンパクに対して IP 可能なのでしょうか？ ああ、これは分かりませんね。痛いところです。 IPはエクストラでない本来の抗原に関しては 働く条件は持っています。 > なかなか難しそうな内容ですが、他には巨大ゲル版で流し、対応するバンドを直接切り出して MS 解析とか？ これって可也いろいろ交じってきませんか? もともとが動物組織のライセートなので、、、、 > 当然いくつか出てくると思いますが、それらを recombinant で発現させ、抗体の反応性を見るというのはどうでしょう？ > もしくは貴重なサンプルで消費したくないというのであれば、expression library を用いて cloning とか？ 今の段階でいろいろなことをそうていしていて、 総べてのことに対応できるような感じでの アプローチを考えています。 サンプルは変性条件下(SDSを可也含む)ので 直接IPはまず無理と考えています。 現状SDSなしでサンプルを得るのは難しいという 状況でもあります。 でこのエクストラのバンドですが、ビベイビアーを考えると 同じ抗原せいをもつ違う蛋白なのか、それとも本来の抗体の 抗原が何らかの理由で高分子側にシフトしたのか、、、 などと考えめぐらせています。 なので、ペプチドシーケンスとかに持ち込みデーターベースを 参照するような形では修飾とか思いもよらないマスの値は 跳ねられてしまいます。 なのでピュアーな形に持っていってより詳細にマスの値が 見れるのが理想的とは思っています。 2Dに持ち込むと今のママではサンプルも乗せられないですし、 アセトンとか使って、ウレアとか入っている2Dに持ち込んだ時に 同じサイズに物が出てくるか分かりません(何らかのアグリゲーション の可能せいもあるかもしれないので)。 なのでSDSPAGEでますそのサイズ付近を取ってきて、エレクトロエリューション して、SDSが十分低い(0.03%みたいな、、)状況で若干TRITONとか加えて、 何とかIPに持ち込み、さらにピュアーにとか考えてます。 IPしないのであれば、何か他のオプションとかないかと で、同じ実験をやっている人はいないかもしれませんが、 こんな実験の場合こうだったから、うまく行かないとか、 ここは気をつけた方がいいと言う様な話があれば、 助かるなあって思っているわけです。

(無題) 削除/引用 No.655-2 - 2009/06/15 (月) 06:46:58 - お世話サマー おおさん、いつもお世話になっております。 その抗体は、エキストラバンドのタンパクに対して IP 可能なのでしょうか？ そこが一番ネックになりそうな気が・・・。 なかなか難しそうな内容ですが、他には巨大ゲル版で流し、対応するバンドを直接切り出して MS 解析とか？ 当然いくつか出てくると思いますが、それらを recombinant で発現させ、抗体の反応性を見るというのはどうでしょう？ もしくは貴重なサンプルで消費したくないというのであれば、expression library を用いて cloning とか？ IP 後の MS は抗体のシグナルも当然拾ってしまいますが、サイズが違えばほとんど混入しませんし、入ったとしてもケラチン同様無視すればよいかと思われます。

抗体でひっかかるたんぱく質のどうてい 削除/引用 No.655-1 - 2009/06/14 (日) 14:25:47 - おお 細胞のライセートからをウエスタンすると、 目的のバンド以外にエクストラのバンドがでます。 でこれがノンスペでないことが確認できたとして、 どの様な方法でそのバンドの対象の物を同定する のがいいでしょうか? ライセートは貴重なもので新たに作ることが 非常に難しいので、変性条件下のサンプルが スタートとなりそうです。 SDSPAGEをして、そのバンドあたりを切り出して、 エレクトロエリューション後IPみたいな感じでしょうか? それか等電点かなぁ、、でもちょっと分け合ってSDSはOKだけど 他の変性剤使いたくないんですよね、、 そして、その後マスとか、、、、 加えて聞きたいのですが、IP後マスに持ち込む時 抗体とかいろいろなシグナルを拾ってしまいませんか? ご経験のある方とかのコメントが聞けたらうれしいです。 それ以外のコメントも大歓迎です。

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