ELISAの検出法には@発色法colorimetric,A蛍光法fluorometric,B化学発光luminometric,CRIA radiometricがあるかと思いますが、最も多用されているのはいわゆる普通のplate readerで読める@かと思います。
@については、HRP,ALP,AchEなのど酵素にさまざまな基質を加え発色させるため、基質を加えてからstop solutionを加えるまで、次第にｼｸﾞﾅﾙが増加してゆくのが特徴で、ﾎﾟｲﾝﾄとしてはsampleのｼｸﾞﾅﾙが、plate readerの検出感度より大きくなるか、基質の最大反応許容量に近づくと定量性がなくなってくるということでしょうか。よってProtocolなどには推奨の反応時間が書かれていると思われるのでそれを参考にされたらよろしいかと思います。
ABについても、酵素とsubstrateを反応させる段階では@と同じことが言えると思われるのですが、蛍光物質、luminolなどの化学発光物質は時間と共にそのｼｸﾞﾅﾙが減弱してゆくと思われますので、これらを加えてからは出来るだけ早くdataをとるようにしています。しかし、私自身、推奨時間を超えて計測したこと無いので、明らかにSignalが減ったという経験はありません。
ハムサンドさんがおっしゃるように発色法では検出するタイミングでOD値が変わる（時間と共に増加する？）と思われますが、発色反応が充分進んでいない段階やあるいは発色が飽和してしまっている状態以外では定量性は保たれるように思うのですが、実際、どのような検量線が描けて、どのように異なる結果が出たかをお書きになれば、より詳しいアドバイスがいただけるかもしれません。
参考になれば幸いです。 |
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