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CTLの増やし方 トピック削除
No.629-TOPIC - 2009/06/08 (月) 19:42:39 - CTL
いつも拝見しております。
さて、今回、癌細胞に強く発現するタンパクAをDCにパルスしてPBMCと共培養してタンパクAに特異的なCTLを誘導しようと考えました。

色々な文献を探しましたが、
「1x10^5個のPBMCとPBMCを加え、3、6、9日目に培養上清を捨て、ペプチドを加え再刺激した。10-13日目に培養細胞をエフェクター細胞として回収し、腫瘍抗原ペプチドをパルスした癌細胞株と共培養した。この方法によって得られた抗原特異的CTL株をアロのHLA-A2+由来のバフィーコートより分離したPBMCに放射線照射したものと4週間共培養し増やした後にCTLを回収した」
とありました。

ここでなぜ、以下のことが疑問になりました。
@抗原特異的CTL株をアロのHLA-A2+由来のバフィーコートより分離したPBMC  に放射線照射して共培養するということは、10-13日では誘導できるCTL細 胞が少なすぎてELISA、Crリリースで使えないからなのでしょうか。

A抗原特異的CTL株をアロのバフィーコートより分離したPBMCに放射線照射し たものと言うのは、いわゆる移植みたいで、抗原特異的CTL株を増やそうと 思って、HLAが同じで違う人のPBMCを加えてCTLを増やしているのでしょう か。それにしても放射線を照射すると抗原特異的CTL株に反応するCD4+と 
 CD8+はなくなるのでしょうか。

最後によろしければ皆さんはどのようにCTLを誘導しているのかお聞かせいただけたらうれしいです。
 
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(無題) 削除/引用
No.629-7 - 2009/06/15 (月) 20:26:15 - HLA
ともさん、
ご返答ありがとうございます。
さて、

>抗原特異的CTL株をアロのバフィーコートより分離したPBMCに放射線照射
したものと言うのは、いわゆる移植みたいで、抗原特異的CTL株を増やそう
と思って、HLAが同じで違う人のPBMCを加えてCTLを増やしているのでしょう
か。
TCRがもう決まっているタンパクAに特異的なCTL株をアロの細胞と混ぜたときってアロ反応って起きないと思うのですが?

についてですが、
@タンパクAに特異的なCTLとは理想的に言うとCTLしか存在しておらず、アロのPBMCと共培養してもアロPBMC中のDCと反応しないからアロ細胞もCTL株も増えないのでしょうか?
Aアロ細胞は当然増えず、CTL株も増えず、なら何が増えるのでしょうか。
Bクロムリリースにもっていくときに患者さんの細胞傷害活性を検討する際、エフェクター細胞はCTL株とアロ細胞の共培養したものになるのでしょうか。CTL株だけ共培養後には分離できないですよね。


>最後によろしければ皆さんはどのようにCTLを誘導しているのかお聞かせいただけたらうれしいです。
PBMCにマイトマイシン処理したがん細胞を混ぜて、数週間培養。
増殖してきた細胞をクローン化して、ペプチドに反応する細胞をCLT株とする。もしくは、一か月くらいマイトマイシン処理したがん細胞を共培養して増えてきた細胞をCTL株と呼ぶ。

についてですが、
ペプチドに反応する細胞はペプチドをもつ癌細胞を全て取り込んだ細胞ということでしょうか。

以上、返答お願いします。

(無題) 削除/引用
No.629-6 - 2009/06/13 (土) 12:30:44 - とも
>についてですが、このときアロ細胞は増えずにCTL株が増えていくということでしょうか。

もちろんアロ細胞は放射線照射しているので増えないです。
このときCTL株も増えないと思うのですが。
このアロ細胞がタンパクAを発現しているのなら増えると思います。
でもアロ細胞はタンパクAを発現していないんですよね?

(無題) 削除/引用
No.629-5 - 2009/06/12 (金) 23:34:39 - HLA
ともさん、お返事どうもありがとうございました。
色々な新しいことがわかり、勉強になりました。
さて、
>色々な文献を探しましたが、
「1x10^5個のPBMCとPBMCを加え、3、6、9日目に培養上清を捨て、ペプチドを加え再刺激した。

意味がわかりません。PBMCとPBMCを加えってどのような操作ですか?アロの関係にあるPBMC同士ってことですか?

についてですが、1x10^5個のPBMCとPBMCを加え、ではなく1x10^5個のPBMCとペプチドを加え、の誤りでした。すみませんでした。


>抗原特異的CTL株をアロのバフィーコートより分離したPBMCに放射線照射し たものと言うのは、いわゆる移植みたいで、抗原特異的CTL株を増やそうと 思って、HLAが同じで違う人のPBMCを加えてCTLを増やしているのでしょう か。

TCRがもう決まっているタンパクAに特異的なCTL株をアロの細胞と混ぜたときってアロ反応って起きないと思うのですが?

についてですが、このときアロ細胞は増えずにCTL株が増えていくということでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.629-4 - 2009/06/10 (水) 15:51:41 - とも
>色々な文献を探しましたが、
「1x10^5個のPBMCとPBMCを加え、3、6、9日目に培養上清を捨て、ペプチドを加え再刺激した。

意味がわかりません。PBMCとPBMCを加えってどのような操作ですか?アロの関係にあるPBMC同士ってことですか?

>抗原特異的CTL株をアロのバフィーコートより分離したPBMCに放射線照射し たものと言うのは、いわゆる移植みたいで、抗原特異的CTL株を増やそうと 思って、HLAが同じで違う人のPBMCを加えてCTLを増やしているのでしょう か。

TCRがもう決まっているタンパクAに特異的なCTL株をアロの細胞と混ぜたときってアロ反応って起きないと思うのですが?

>ですが、これだったら例えば、患者さんの細胞傷害殺傷能を見たいときに、allo細胞の健常者の抗原特異的CTLを加えたら患者さんの細胞傷害殺傷能がみれなくなりますよね。allo反応を起こしたら、いったい誰の抗原特異的CTLが細胞傷害をしているのか分からなくなると思います。実験する意味があるのでしょうか。

これはCTL株の樹立を行う実験ではないのですか?
最終的にはできたCTL株と放射線照射したPBMCにペプチド加えてCTLが増殖するかとかをみるんじゃないですか?


>最後によろしければ皆さんはどのようにCTLを誘導しているのかお聞かせいただけたらうれしいです。

PBMCにマイトマイシン処理したがん細胞を混ぜて、数週間培養。
増殖してきた細胞をクローン化して、ペプチドに反応する細胞をCLT株とする。もしくは、一か月くらいマイトマイシン処理したがん細胞を共培養して増えてきた細胞をCTL株と呼ぶ。

(無題) 削除/引用
No.629-3 - 2009/06/09 (火) 21:28:49 - HLA
>それにしても放射線を照射すると抗原特異的CTL株に反応するCD4+とCD8+はなくなるのでしょうか。

違うと思います。放射線照射によりallo細胞の「増殖」を止めてるだけだと思います。
ですので、allo反応を起こすと抗原特異的CTLだけが増殖するようになります。


ですが、これだったら例えば、患者さんの細胞傷害殺傷能を見たいときに、allo細胞の健常者の抗原特異的CTLを加えたら患者さんの細胞傷害殺傷能がみれなくなりますよね。allo反応を起こしたら、いったい誰の抗原特異的CTLが細胞傷害をしているのか分からなくなると思います。実験する意味があるのでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.629-2 - 2009/06/09 (火) 12:00:25 - 経験者
>HLAが同じで違う人のPBMCを加えてCTLを増やしているのでしょうか。

alloですからHLAは違うのでは?
たぶん最初のうち抗原特異的CTLを作っておいて、あなたが仰る通りその絶対数を増やすためにallo反応で増やそうとしたのではないでしょうか?リンパ球混合試験のように。

>それにしても放射線を照射すると抗原特異的CTL株に反応するCD4+とCD8+はなくなるのでしょうか。

違うと思います。放射線照射によりallo細胞の「増殖」を止めてるだけだと思います。
ですので、allo反応を起こすと抗原特異的CTLだけが増殖するようになります。

CTLの増やし方 削除/引用
No.629-1 - 2009/06/08 (月) 19:42:39 - CTL
いつも拝見しております。
さて、今回、癌細胞に強く発現するタンパクAをDCにパルスしてPBMCと共培養してタンパクAに特異的なCTLを誘導しようと考えました。

色々な文献を探しましたが、
「1x10^5個のPBMCとPBMCを加え、3、6、9日目に培養上清を捨て、ペプチドを加え再刺激した。10-13日目に培養細胞をエフェクター細胞として回収し、腫瘍抗原ペプチドをパルスした癌細胞株と共培養した。この方法によって得られた抗原特異的CTL株をアロのHLA-A2+由来のバフィーコートより分離したPBMCに放射線照射したものと4週間共培養し増やした後にCTLを回収した」
とありました。

ここでなぜ、以下のことが疑問になりました。
@抗原特異的CTL株をアロのHLA-A2+由来のバフィーコートより分離したPBMC  に放射線照射して共培養するということは、10-13日では誘導できるCTL細 胞が少なすぎてELISA、Crリリースで使えないからなのでしょうか。

A抗原特異的CTL株をアロのバフィーコートより分離したPBMCに放射線照射し たものと言うのは、いわゆる移植みたいで、抗原特異的CTL株を増やそうと 思って、HLAが同じで違う人のPBMCを加えてCTLを増やしているのでしょう か。それにしても放射線を照射すると抗原特異的CTL株に反応するCD4+と 
 CD8+はなくなるのでしょうか。

最後によろしければ皆さんはどのようにCTLを誘導しているのかお聞かせいただけたらうれしいです。

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