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同じ悩み経験有り！ 削除/引用 No.626-5 - 2009/06/24 (水) 20:30:46 - birdholic ビオチンのアビジンとの結合サイトは一個なので既にアビジンと結合しているビオチンはさらにアビジンと結合することが出来ないというのがBlockingの原理です。 この為、Blockingをすると切片はビオチンまみれになりますが、その中にアビジンと結合できるビオチンはありません。その上でアビジンと結合していない（結合可能な）ビオチン化抗体で処理をするという原理です。 Blockingによって結果が全く変わらないということであれば主な問題は他にあるのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.626-4 - 2009/06/07 (日) 19:52:56 - kazu ami様 in situ様質問に答えていただき本当にありがとうございます。 ビオチンが一価の結合部位しか持たないということを知りませんでした。 なんと明快な説明だと驚嘆いたしてしまいました。 アビジンの残りの三価の結合部位をビオチンで飽和しておかなければbiotin conjugate antibodyがそこに結合してしまうことは理解できていたのですが、それにしてもビオチンが一価だったとは・・・。 目からうろこです。 本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.626-3 - 2009/06/07 (日) 14:29:12 - in situ 経験者です。 結論からいえばうまくいきます。 自分はPIERCEのブロッキングキットを使っていますが、ほとんどノンスペが消えました。 で、スレ主さんの疑問ですが、ビオチンのアビジン結合部位は一か所しかありません。 しかるに、ブロッキング用に加えたビオチンに関しては、ブロッキング用のアビジンに結合するか、その後のwashによって洗い流されるかになります。 アビジンに結合したビオチンは、すでにアビジン結合部位がアビジンによってふさがれているのでstreptoavidin-HRPには結合できません。

(無題) 削除/引用 No.626-2 - 2009/06/07 (日) 14:27:34 - ami avidinは4価（？）だけどbiotinは1価（？）だったはず。価っていうのかな。

内因性ビオチンブロッキングについて 削除/引用 No.626-1 - 2009/06/07 (日) 13:38:04 - kazu 免疫染色時の内因性ビオチンブロッキングについてふと疑問に思ったことを質問させてください。 マウスのkidneyでの免染でnon-specific signalが出てしまい、内因性ﾋﾞｵﾁﾝの存在を疑って、Dakoより内因性ビオチンブロッキングのKitを購入しました。説明書を読んだところ、まずAvidin試薬にて組織を処理し、Wash後にbiotin試薬にて処理すると書いてありました。 そこで疑問に思ったのですが、biotinにて処理してしまったらその後に反応させるstreptoavidin-HRPと加えたbiotinがまた反応してしまい、結局内因性biotin blockingの意味がなくなるのではと思ったのです。 PIERCEのホームページ上のTec Tipの項を参照したところ、avidinのBiotin結合部位は4つあり、biotin処理にて残りのbiotin結合部位を飽和するといったような内容の記載がありましたが、その後のSA-HRPが、後で添加したbiotinに結合してしまうことには変わりないと思ったのですがいかがなものでしょうか？まったくとんちんかんなことを質問しているかもしれませんが、実際このkitを使ってもbackは消えなかったもので、avidinの後に加えるbiotinの意義に頭をかしげているところです。実際うまくいっている経験者の方でavidin反応後のbiotinの意味を知っておられる方がいらっしゃいましたら教えていただけないでしょうか？よろしくお願いいたします。

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