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(無題) 削除/引用 No.618-22 - 2009/06/08 (月) 23:52:05 - C こういうところは、先生っぽくひとを説教するようなところじゃないし、忙しい中無理に指名して回答を求められてる訳でもないのだから。あんまり怒ったりとかふてくされたりとかしないで、答えてあげるなら、目の前に相手がいるつもりで、感情的な言い方は極力抑えてサイエンティスト風というか紳士的に振る舞ったほうがいいね。べつに厳しい事書かなくても全然回答付かなければ、書いた内容や情報が不十分かなとか、これは世間的にはまずは自分で調べるレベルかなとか察しつくのだから。 いろんな人がいろんな環境で研究してるし、最近は専門が細分化しまくってるから、指導教員自身が経験ない実験を学生にやれ言う人もときどきいるから、具体的なこと聞けるひとが周りにいないそういう人には、現実問題としてこういうサイトは貴重なのだから、もう利用しませんけどとかなるのはよくないね。なによりも経験もバックグラウンドも千差万別だしね。それに状況変われば自分が逆の立場になることも十分あり得るのだから。

(無題) 削除/引用 No.618-21 - 2009/06/08 (月) 22:24:24 - CJ 凡人さん もうここを見ていないかもしれませんが > ＞可能性まで考えられるのに対処が考えられないのですか？ > > そうなんです。そういうことありませんか？ > いろいろ考えられるけど、結局どうなんだ？って思うこと。 思うに実験というのはほぼ全てトラブルシューティングからできていると思うのですよね。研究ってもの自体もそうかもしれません。ですから最終的には実験者自らが様々な可能性から対処法を考えなければならないのだと思います。ここでのアドバイスは（ＰＩのアドバイスさえも）常に的外れである可能性がありますから。 ただ、自分とは違う分野の人は「いろいろ考えられる」の「いろいろ」の中身が大分違うことがあるので、だからこの掲示板は有用であるのかもしれませんね。他の人はどうか知りませんが、私はよく目から鱗が落ちています。 > もうここは利用しないようにします。 対面して話さないときには文章の内容がきつくなりがちです。なぜこのような荒れた場になってしまったかお考えになって、また質問されれば良いと思いますよ。 凡人さんがすでに教授とかで、他の人の機嫌をうかがう必要がない立場でないならば、メール、書状、掲示板などといった文面で、相手に失礼でない形で自分の伝えたい内容を書く訓練をされることは、凡人さんが将来どのような道に進むとしても極めて有益なはずです。（ちなみに私はこれができていませんので、いつも意図せず人を怒らせてしまいます。） スレ違い失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.618-20 - 2009/06/08 (月) 21:15:25 - ami ＞これは、経験的と言うことでしょうかそれとも何か大丈夫な理論があるのでしょうか？ 人が可能性いろいろ考えてるときに、バカじゃないとか言って人の話効かない人は、自分で実験やって順番に詰めていけばいいんですよ、自分で。少なくとも、２次抗体が間違ってるとシグナルでないから、それ以前からやり直せばいいってわかるでしょ、ということです。理論じゃないです、すいません。

(無題) 削除/引用 No.618-19 - 2009/06/08 (月) 18:40:06 - R ami様 >>そのまま発色でいいと思うのに、、 ウサギ一次抗体には、マウス二次抗体でも大丈夫と言うことなのでしょうか？ これは、経験的と言うことでしょうかそれとも何か大丈夫な理論があるのでしょうか？ 興味ありますので、ご回答よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.618-18 - 2009/06/08 (月) 18:26:36 - ami うぅ、 そのまま発色でいいと思うのに、、

(無題) 削除/引用 No.618-17 - 2009/06/08 (月) 11:37:06 - ### >[Re:16] 凡人さんは書きました : > 何を熱くなっているのか、わかりません・・・。 なんだか根本的に勘違いをされているようですね。 >[Re:7] 凡人さんは書きました : > 申し訳ありませんが、いろいろな可能性はそこまでおバカではないので（凡ミスはしますが） > あげてもらわずとも自分で考えます。 この表現は回答者に対して失礼なものだと感じませんか？ 感じないのであればしょうがないですね。 >[Re:16] 凡人さんは書きました : > マテリアルの詳細がわからないので、可能性をおっしゃられてもしょうがないと思うのです。 > だから、どんなサンプルかわからないのでもいいから、 > 実際、やったときはどんな感じだったかを聞きたかっただけです。 > そうなんです。そういうことありませんか？ > いろいろ考えられるけど、結局どうなんだ？って思うこと。 > だから、全く違うサンプル、一次、二次抗体でもいいので > 実際やった人はどうだったか聞きたかったのです。 そうですか？ 今回のケースの場合、私は二次抗体がどういったものなのか、一次抗体がどういったものなのか、これらの情報で対処を考えます。 今回のケース以外にも分らないのであれば分るように検討を自分で行います。 それでも結果が得られなければ初めて、こういった場でみなさんの意見を求めます。 回答者の方々がこまかな情報を求めるのは質問者のトラブルを親身になって、 責任感をもって最善の対処法を一緒に考えようとしているからだと思いませんか？にもかかわらず > あげてもらわずとも自分で考えます。 と一刀両断で切り捨てるのはあまりにも礼を失するものだと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.618-16 - 2009/06/08 (月) 10:37:08 - 凡人 何を熱くなっているのか、わかりません・・・。 逆ギレ様、み様、A様、###様 ありがとうございました。 マテリアルの詳細がわからないので、可能性をおっしゃられてもしょうがないと思うのです。 だから、どんなサンプルかわからないのでもいいから、 実際、やったときはどんな感じだったかを聞きたかっただけです。 み様 なんか、デーダをだしなはれや、とか、どうしてそんな貶された感じに言われなければならないのか理解に苦しみました。 逆切れ様 私のように失敗した人がいなければ、それでいいのです。 そうか、情報無いのかと思うだけです。 ###様 ＞あきれた。 ＞可能性を考えないと対処できないでしょうに。 ＞可能性まで考えられるのに対処が考えられないのですか？ そうなんです。そういうことありませんか？ いろいろ考えられるけど、結局どうなんだ？って思うこと。 だから、全く違うサンプル、一次、二次抗体でもいいので 実際やった人はどうだったか聞きたかったのです。 C様 ありがとうございます。そういう経験談が聞きたかったのです。 何故、他の皆さんはこういう話を聞きたいんだなって思ってくれないのでしょうか・・・。 もうここは利用しないようにします。

(無題) 削除/引用 No.618-15 - 2009/06/07 (日) 08:56:40 - R ami様 >>そのまま発色でいいと思うのですが、、 私の読解力がないだけだと思いますが、 間違った二次抗体でも発色させて大丈夫と言うことでしょうか？ 一応、失敗を確認すると言うことでしょうか。 さすがに、二次抗体くらいはやり直した方がいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.618-14 - 2009/06/06 (土) 13:14:52 - ami いろいろ出てましたが、、 ＞ それで、やり直すには一次抗体からやり直した方が良いと思いますか？ ＞ それとも、二次抗体からやり直せば良いでしょうか？ そのまま発色でいいと思うのですが、、

(無題) 削除/引用 No.618-13 - 2009/06/05 (金) 21:17:00 - C あるね、ある。そういう時は、タッパーの中で、水で膜をあらってから、また普通にはじめのブロッキングから全行程やり直してます。（２次抗体間違えると大抵は全くシグナル出ないので、ストリップしませんでした。でも途中で、失敗したと気づいても、やめないで、やりたくなくてもここまでは一応確認してからやり直してください。）結果は、普通にやったのと比べても、特にどうという違いはないです。ただサンプルがマウスやラットの臓器とかだと血が混じってる関係で内在性のIgGが抗マウスIgG２次抗体と反応してバンドが何本か現れるから、もしも見たいタンパク質がその辺にあるならストリップが必要になります。あと間違えてヤギつかうとバックがすこし高くなるかもしれない。 私の経験の範囲のはなしですが、１次抗体は、洗ってやり直しても抗原蛋白質には結合したまま残ってます。だから、少しブロッキングして、２次抗体からやってもでもシグナルは普通に出ます。だから単にバンド出ればいいみたいな感じの実験ならこれでもいいのかもしれないけど、何かと何かを比較してどのくらい増えましたけどみたいな見方したいならば、やっぱブロッキング、１次抗体、洗い、２次抗体、洗い、のようにはじめからやり直した方がいいです。 たくさんの膜を同時に免疫検出やる時とかで、それぞれ違う抗体で、それがまたウサギもマウスもヤギもあるとかだとかなりあぶないですね。そういうときはチューブとかいろんなところに大きくMとかRとか書いておくようにして、お腹すいてる時とかじゃないとき、時間的にも余裕のあるときに落ち着いてのんびりやることにしてます。慣れてくると膜5〜6枚くらい抗体4〜6種類くらいまでなら調子に乗ってついつい同時にやりたくなるけど、自信無い時は抗体4種類以上は同時にやらない方がいいかも。 得意でない実験は友達や技術スタッフに頼んでやってもらったりしてる人もいるし、周りから一目おかれてるような研究者でも、たまに、あまり格好の良くない不注意ミスしてるの知ってるし（本人が言わないだけで。）、研究能力と実験の上手下手や実験のペースはあんまり深い関係はないとおもうので、気にせずに自分に合った感じで進めればいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.618-12 - 2009/06/05 (金) 18:57:31 - み >[Re:11] ###さんは書きました : > > 最初からやり直したらいいんですよ。 > それが貴方の提示した情報から言える一番確実な対処法です。 > ん？研究者を最初からやり直すということに過大解釈しそうになったのは僕だけ？

(無題) 削除/引用 No.618-11 - 2009/06/05 (金) 18:46:34 - ### あきれた。 可能性を考えないと対処できないでしょうに。 可能性まで考えられるのに対処が考えられないのですか？ その考えられないところを他の人の経験や知恵、すなわち他の人の財産を拝借しようと言うのにこの高慢な態度はないでしょう。 最初からやり直したらいいんですよ。 それが貴方の提示した情報から言える一番確実な対処法です。

(無題) 削除/引用 No.618-10 - 2009/06/05 (金) 18:32:09 - A メンブレンが多数あるのであればまずは抗ウサギ抗体の２次抗体で 反応させて結果を見てみては？その後でも抗体を剥がして１次抗体 からやり直すことはできますから。念のためですが私の経験では 一度反応した抗体を剥がす処理を行うと多分膜上の抗原もいくらか 剥がれるからだと思いますがシグナルが弱くなりますからもし微妙な シグナルを拾っているのであれば手間ですがブロッティングから やり直す必要が出てくると思います。

(無題) 削除/引用 No.618-9 - 2009/06/05 (金) 18:29:19 - 逆ギレ そんな失敗をする人が「皆さん」と言うほど沢山いるとは思えませんね。 しかも、ウェスタンのバックグラウンドなんて抗原と一次抗体によりけりなのに、他の例がそれほど参考になるとも思われませんが。

(無題) 削除/引用 No.618-8 - 2009/06/05 (金) 18:27:07 - み >[Re:7] 凡人さんは書きました : > 私はメンブレンが多数あり手間だと思ったので、やったことがある人の話を聞きたかったのです。 > 申し訳ありませんが、いろいろな可能性はそこまでおバカではないので（凡ミスはしますが） > あげてもらわずとも自分で考えます。 > 考えたからこそ、実際はどうされて、どのような結果になったかを知って判断したかったのです。 > > 宜しくお願い致します。 何言ってるの？って感じですね。 １次抗体と２次抗体の質、研究している手が変われば上手くいくものもあればノイズに埋もれてしまって結局stripしてやり直さないといけない場合もあるでしょう。 皆さんはマテリアルの詳細がわからない以上、可能性をコメントするしかない。 可能性を考える能力あると言うのなら、あとはそれぞれの１次抗体と２次抗体の質はあなたしか知らないのだから、あんたの気が済むようにやったらええんやないんっすか？ってことになるでしょ。 stripしてシグナルが弱くなる危険性があるなら僕が最初に一言で済ませたように２次抗体からやり直してシグナル出す。それで駄目ならstripってのが時間のロスすくないやろ。まあこの辺も全てお分かりなのでしょ〜けど。 さっさとデータだしなはれや。

(無題) 削除/引用 No.618-7 - 2009/06/05 (金) 18:11:58 - 凡人 私はメンブレンが多数あり手間だと思ったので、やったことがある人の話を聞きたかったのです。 申し訳ありませんが、いろいろな可能性はそこまでおバカではないので（凡ミスはしますが） あげてもらわずとも自分で考えます。 考えたからこそ、実際はどうされて、どのような結果になったかを知って判断したかったのです。 宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.618-6 - 2009/06/05 (金) 16:24:03 - ### 用いられた抗マウス抗体のホストがウサギであった場合、 抗マウス抗体の非特異的反応が増幅される可能性があるかもしれませんね。 二次抗体からやってみてダメであればリプローブしてやり直す、あるいは最初から一次抗体からやり直すだけのことでそんなに手間なことのように思いませんが...私なら変なことが起こるとイヤなので最初から後者にしますね。

(無題) 削除/引用 No.618-5 - 2009/06/05 (金) 16:20:49 - 凡人 すみません、読解力が無いもので・・・ 結局、皆さんが、そうされたときはどうでしたのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.618-4 - 2009/06/05 (金) 15:57:35 - おお バンドが出るかどうかは1次抗体次第だと思います。 相互作用の弱い抗体は、洗いの回数が多くなるだけ 顕著にシグナルが弱くなるのではないかというのが 私の考える懸念です。

(無題) 削除/引用 No.618-3 - 2009/06/05 (金) 15:48:00 - A 抗マウス抗体によるバックが問題になっていないのであればみさんの おっしゃるように２次抗体からで問題ないと思います。もしバックが 気になるのであればメンブレン上の抗体を除いた上で１次抗体から やり直しだと思います。

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