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タンパク質FAA固定後の解離方法について 削除/引用 No.616-12 - 2009/06/11 (木) 15:30:01 - FAA とりあえず分かったと思ってみていなかったのですが、その後こんなに話が続いていたとは知りませんでした。 そうなんですか、FAA固定でも、DTTの入ったSDS-PAGE用のDyeとボイリングで架橋がはずせるんですか。それが可能であれば、一番楽で、他の実験とも整合性がつくので一番ありがたいのですが。一度試してみるべきでしょうね。私は、てっきり架橋がはずせないと思いこんでいたので、質問した次第でございます。 今実験の準備中なので、そんなに早くはできないですが、結果が出たらご報告させていただきます。私の場合は、ウエスタンで検出を考えていますので、同じ複合体にいれば（近くにいれば？）それなりに結果は出せると考えています。 今まで、FAA固定したサンプルを使用し、ChIPは何度もやっていたので、核酸のはずし方は分かっていたのですが、タンパクとなると報告例も見つけられずじまいでして。。。。 いろいろと参考になる意見をありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.616-11 - 2009/06/06 (土) 21:16:55 - 家具屋 なるほど、そうとは知りませんでした。そういえば、ホルマリン固定した組織からPCRできるのもそういう訳なのかな。マルチマーを作るので、架橋剤よりいい場合もありそうです。勉強になります。

おおさんへ　参考になるか分かりませんが 削除/引用 No.616-10 - 2009/06/06 (土) 15:58:55 - み >[Re:7] おおさんは書きました : > >[Re:6] 平戦闘員さんは書きました : > > 「済」にされたようですが、ちょっと待ってください。ホルマリン固定は悪く無いですよ。ChIPと同様、DTTの入ったSDS dyeでボイルしてやるだけでかなり外れます。 > > 興味深く読ましていただきました。 > タンパク相互作用で使用されている例など参照できる物がないでしょうか? > 使えるならやってみようか見たいな気もしますので、、、、 > > 理屈ではまあできないことはないなあと思っていても、CHIP以外では > 使用しているのを見た記憶がないもので、、、、 > > あ、精製したものであったらつかってたかなあ、、、でも外すところまでやったのはタンパク同士ではきおくにないなあ、、 平戦闘員さんの経験は正しいと思います。 以前、自身が作成した抗体にChIP能があるかどうか（厳密に言うとホルマリン処理細胞から抽出した蛋白をIPできるかどうか）を検討していました。 沈降産物をSDSサンプルバッファーでボイルしてwesternすると、normalなバンドパターンを示しました（無固定の普通のIP産物と比して、少しスメアー気味でシグナル弱いですが）。 これといって複合体形成しているような像も見えません。ゲルトップに詰まっている感じでもないです。 最終的な目的がChIPだったのでバッファーはupstate社のkit（確か抽出は１％ＳＤＳ含）を用いて、勿論sonication抽出あり、IP,washしていましたが、どれだけ共有結合保っているのかと疑問に思うくらいです・・・。 クロスリンカーも使用経験ありますが、あれって何か難しくないですか？ クロスリンカーで細胞膜、細胞骨格も含めてガチガチになった細胞から蛋白を効率よく抽出できるのかと・・・。 抽出した後もクロスリンカーが効いているのかIPにもっていけるような状態の抽出物（サラサラの溶液状）が得られない。遠心すると細胞のdebrisがゴリって出てきた記憶がある。 一応、プロトコール通りwashとかやったつもりなのだが・・・。

(無題) 削除/引用 No.616-9 - 2009/06/06 (土) 15:53:26 - 平戦闘員 すみません。二報目のリンクを間違えました。Fig.1のlegendです。 http://jb.asm.org/cgi/reprint/179/18/5699.pdf

(無題) 削除/引用 No.616-8 - 2009/06/06 (土) 15:51:57 - 平戦闘員 当たり前のようにやっていたので文献は持っていなかったのですが、今Googleで検索してみたら次を見つけました。 http://www.natureprotocols.com/2006/10/02/combination_of_chemical_crossl.php http://www.natureprotocols.com/2006/10/02/combination_of_chemical_crossl.php

(無題) 削除/引用 No.616-7 - 2009/06/06 (土) 15:27:55 - おお >[Re:6] 平戦闘員さんは書きました : > 「済」にされたようですが、ちょっと待ってください。ホルマリン固定は悪く無いですよ。ChIPと同様、DTTの入ったSDS dyeでボイルしてやるだけでかなり外れます。 興味深く読ましていただきました。 タンパク相互作用で使用されている例など参照できる物がないでしょうか? 使えるならやってみようか見たいな気もしますので、、、、 理屈ではまあできないことはないなあと思っていても、CHIP以外では 使用しているのを見た記憶がないもので、、、、 あ、精製したものであったらつかってたかなあ、、、でも外すところまでやったのはタンパク同士ではきおくにないなあ、、

(無題) 削除/引用 No.616-6 - 2009/06/06 (土) 14:40:00 - 平戦闘員 「済」にされたようですが、ちょっと待ってください。ホルマリン固定は悪く無いですよ。ChIPと同様、DTTの入ったSDS dyeでボイルしてやるだけでかなり外れます。 例に挙げておられるようなファンシーな二価架橋剤は反応基同士の距離が決まっていて、架橋すべきタンパク質の標的残基がその距離に無い場合には架橋の効率が良くありません（逆にぴったりの距離にある場合にはノンスペが少ない）。それに対し、ホルマリンはマルチマーを形成するようで、標的同士の距離に厳しくありません。 もちろんそのことによるデメリットもあって、近くにいるものはかなり何でも間でも架橋されてしまうので、コントロールをしっかり取る必要があります。また、パートナーの検出にはウェスタンなど標的特異的な方法でないと難しくて、MS解析や銀染色でバンドを出すようなことには不向きです。

タンパク質FAA固定後の解離方法について 削除/引用 No.616-5 - 2009/06/06 (土) 06:08:37 - FAA なるほど、FAAなど汎用的なもの以外にも結構クロスリンカーが存在するのですね。それを知りませんでした。 回答をいただいた後、調べてみたのですが、私の系ではDSPが良さそうです。過去にも使用例が見つかり、上手く行くと思います。 ありがとうございました。非常に助かりました。

(無題) 削除/引用 No.616-4 - 2009/06/05 (金) 14:00:03 - おお CHIPでは固定してIP後にDTT存在下で70度くらいでぼいる するようです。完全に外れるかなあっておもいますが、、、 FAAよりも、タンパク相互作用研究用のクロスリンカー 使った方がスッキリするのでは? 還元状態でクロスリンカーのブリッジを切れるものが ありますので、外すこともできると思います。

(無題) 削除/引用 No.616-3 - 2009/06/05 (金) 12:49:20 - 家具屋 そんな無理ですよ。ホルマリン固定では安定な共有結合が作られてしまいますから。還元剤で切断可能な架橋剤を使わないといけないです。

DSP 削除/引用 No.616-2 - 2009/06/05 (金) 12:13:56 - ats (ホルムアルデヒドでなくDSPやDTSSPをお薦めします。 https://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/22585.pdf 私は、DSPを培養細胞グレードのDMSOに溶かし、培地に添加していました。

タンパク質FAA固定後の解離方法について 削除/引用 No.616-1 - 2009/06/05 (金) 07:48:45 - FAA あるタンパクのインタラクターを同定しようと試みています。FAA(ホルムアルデヒド）で固定した後、IPを行い、その後ウエスタンでインタラクターを検出したいと考えています。IPの後、SDS-PAGEで泳動を行う前に、FAA固定をリリースしなければならないと思うのですが、その方法が探したのですが見つかりません。ご存じの方、教えていただければ幸いです。 ちなみに、今までの実験から、これらのタンパクはダイレクトなインタラクションはしておらず、しかし細胞内局在は同じであることから、ひとつのコンプレックスに含まれていると推測しております。 以上よろしくお願いいたします。

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