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In-gelでのrenaturation 削除/引用 No.614-8 - 2009/06/14 (日) 06:02:45 - Tb 皆さま、アドバイスありがとうございます。 さっそく、一つのモノクロに絞って次の条件を比較してみました。 1) （タイミング調整のため）tranfer buffer (SDSなし、+20% methanol)で〜4 hr → 0.1% Tween-TBSで5 min x2 wash 2) 0.4% Tween-TBS : 〜4 hr 3) Urea : 8 / 4 / 2 / 1 / 0.5 / 0 / 0 / 0 M，各30-40 min 4) Guanidine HCl : 6 / 3 / 1.5 / 0.75 / 0.375 / 0 / 0 / 0 M，各30-40 min をしました。 発色の強弱が毎回異なるというのがはじめの問題点だったのですが、今回はrenatureなしに相当する1)でも10秒露光で十分でした。これがいつものぶれなのか、SDSなしのtansfer bufferがrenaturationを誘導したのか・・・？ 3)のUreaは1)と同等で、2)のTriton 0.4%と4) のGuanidine-HClは逆に1)より弱くなりました。Guanidine-HClの方はpre-stained markerが一部消えてしまったので、タンパクが流れ出たようです。TX 0.4%もやり過ぎではずれたのかもしれません。 いまのところまだ、membrane上でのrenaturationが強い発色に重要という読みが妥当かどうか、についてはまだ結論保留といったところです。 ------------- さて、ほかに調べましたところ、以下の論文を見つけました。 Dunn, SD, Analytical Biochemistry 157, 144-153, 1986 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3532863?ordinalpos=3&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSum renaturationを、membrane tranferの前にin-gelで、というものです。なるほどという気もします。そこでこれをベースにやってみました。 SDS-PAGE後、gelをTBS（Tweenなし）で1 hr incubation（15分ごとに交換）(renaturation) transferはcarbonate buffer (10 mM NaHCO3 /3 mM Na2CO3, pH 9.9) (SDSなし, methanolなし)で。 （かなり発熱させてしまいました。熱でdenatureさせている可能性があるので次回はもっとゆっくりとします） tranfer後は通常のWestern protocolです。 パラレルでやっている比較対象はないので印象の範囲を出ないかもしれませんが、短時間発色で、しかも今までで一番コントラストよく出ました。 再現性チェックも含めてもう少しいじってみようと思いまが、in-gel renaturation、いけるかも、といった感じです。

(無題) 削除/引用 No.614-6 - 2009/06/05 (金) 15:12:13 - in situ １．グアニジンもしくは尿素の濃度を飽和近くから徐々に下げて行く方法 ２．生理的なバッファーで4℃O/N というのをファーウエスタンやノースウェスタンの論文でよく見かけます。

(無題) 削除/引用 No.614-5 - 2009/06/05 (金) 14:11:50 - おお 膜上でリネイチャーが起こる確率は比較的高く、そのため ファーウエスタンに応用できる場合が多いという理屈を 聞いたことがあります。 また、リネイチャーにグアニジンHCl 6Mで浸して、 洗うという方法を、ファーウエスタンのプロトコール で見たことがあります。 TWEENとかに関してはわかりませんが、ファーウエスタン のプロトコールをいろいろ探してみるとこの辺のことは いろいろ発見があるかもしれません。 実際質問者さまの例ではリネイチャーかどうかはよく分かりませんけど、界面活性剤 の濃度を上げることで、抗体のアクセスがしやすくなった ということかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.614-4 - 2009/06/05 (金) 13:04:33 - deter SDSが結合しても、一定の割合で離れますし、特に他の界面活性剤があると、置き換わるようになります。ただ、SDSが離れたときに元通りの立体構造を作るとは限らず、生体内とは違う条件なので、間違った形になることも多いです。これは、正確には、そのときの微妙な諸条件、感覚的には偶然にといってもいいのことに左右されるので、やる度に異なる度合いが得られているんだろうと思います。Tweenをあげると良かったというのは、そのSDSの解離の促進だろうと思います。 その通り、理にかなっているので、できるだけ同じ条件（温度、時間）で、Tweenを少し多めにしてincubateすることで、改善されるのではと思います。塩濃度、Mg2+やものによってはCa2+を入れたりすると良い場合もあります。また、電気泳動するときに、サンプルを還元せずにやると、細胞外の蛋白であれば、立体構造を保持してる場合もあるので、より高い反応が得られるかもしれません。ただ、移動度が変化する場合もありますが。

(無題) 削除/引用 No.614-3 - 2009/06/05 (金) 07:53:46 - u タンパク質を精製したりしているときの感覚的なものですが、 SDSに関しては、タンパク質から簡単に取れるものではないような気がします。 還元剤はどうか知りませんが、そこまで元に戻るとは思いません。 ただ、タンパク質とそれを認識する抗体のサイトによると思いますが・・・。 ECLでの発色時間の違いは、私は発色液の温度の違いで似たような経験があります。 結構、ここで時間的なムラが出るときもあります。４℃出したてでは検出悪かったり。

訂正 削除/引用 No.614-2 - 2009/06/05 (金) 02:31:16 - Tb 質問主です。洗いはTX100ではなくてTween20-TBSTの間違いでした。

SDS-PAGE後のmembrane上でのrenature 削除/引用 No.614-1 - 2009/06/05 (金) 02:15:18 - Tb 現在モノクロ取りをしています。スクリーニングはFACSで行いましたので、とれたクローンすべてはnative comformationを認識するものになります。 さて、FACSに使えるものという第一の目的は果たしほっとしたところで、次にWesternでも使えないかなとクローン間の比較をしております。ところが同じクローンでもECLの発色にかかる時間がやるたびにものすごく異なります（2秒の時もあれば2分の時も）。一度に複数のクローンでWesternの染色をしていますが、弱い回はすべて弱くなります。 私が考えましたのが、ブロットのあとのメンブレンの洗い中にrenatureが起きていて、この程度が毎回異なるのではというものです（ブロットのあとの洗いは毎回適当で短いときもあれば長いときもありました）。まだ一回だけしかしていませんが、試しに洗いをTriton 0.1%から0.4%にあげて室温３０分にしてやってみたところ、短時間で発色しました。 そこで質問なのですが、メンブレン上でのrenatureを誘導するのになにかよく使われる手というのがあるのでしょうか？ ちなみにTriton 0.4%というのはそのように条件を検討している論文でみつけました。

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