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ありがとうございます。 削除/引用 No.612-6 - 2009/06/04 (木) 22:29:41 - momon 目的たんぱく質はウエスタンブロットで検出していますが、タグに対する交代を使用しても、ものすごいノンスペが出てしまいます。 また様々な抗体でIPを試しましたが、バンドのバの字も検出できませんでした。 このようなtransgene-タンパク質の検出ができないマウスで行動実験、薬剤抵抗性などの実験をするのはやはり無謀でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.612-5 - 2009/06/04 (木) 22:24:51 - ats CMVプロモーターは生体内で不活性化されやすいと聞いています。 そのため、ｍRNA量が非常に少なく、タンパクが検出限界以下ということではないでしょうか。 ｍRNAはRT-PCRで検出しているのでしょうか。 半定量でも構いませんがｍRNA量はそれなりに検出していますか。 ここからは、一般的な確認事項です。 もしそうなら、genome DNA由来ではないことを保証するRTなしの陰性対照は取っていますか？ もしくはイントロンをはさんだプライマーをお使いでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.612-4 - 2009/06/04 (木) 22:01:25 - み よくあることでしょう。 単に発現量が少ないだけという理由が一番多いような。 IPなどで濃縮して検出したり、１レーンに多めに流したり工夫しないと検出できないレベルなのでしょう。 細胞と違って組織だと細胞外蛋白などの割合も多いからsourceが変わっただけでも（細胞から組織）検出しにくくなるでしょう。 １細胞あたり強制発現の100分の１くらいの発現量でも不思議ではない。 何の手法での検出か知らないですがmRNAで確認できるのはあたりまえ。例えば神経特異的に蛋白発現しているとされるものでも、PCRだったら他の組織からでもいくらでも増やせる。 でもあなたが蛋白検出できないと判定しても、もっと上手い人がやったら検出できる可能性は大いにある。 うちのラボでも前任者２人が検出できなかったマウスで、３人目が検出した例ある。

ありがとうございます。 削除/引用 No.612-3 - 2009/06/04 (木) 21:11:09 - momon 早々のご返答ありがとうございます。 Tgマウスの作製前に腎臓由来細胞（HEK293）、神経由来細胞（SHSY5Y）を用いたタンパク質過剰発現モデルでタンパク質の確認条件などはクリアしております。 さらに様々な検出条件を検討しましたが、どうも検出の糸口さえ見つからない状況で困り果てています。 検出条件のせいではなく、Tgマウスという人工強制的な条件が原因でこのようなことが起こっているのであれば、どこかで見切りをつける必要もあるかと思っています。

(無題) 削除/引用 No.612-2 - 2009/06/04 (木) 20:54:44 - ~ Tgマウスを作る前に、その発現ベクターを適当な細胞に入れてたんぱく質レベルでの発現を確認しているのでしょうか？ フレームシフトなどでたんぱく質にならない 抽出時に沈殿などにいってしまう？ たんぱく質が大きくてウェルにうまく入らない？ などは、まずは適当な細胞で見ておいたほうが効率がいいと思いますが。 どこまでベクターや検出条件を確認した上で、今回のトラブルが起きているのかによって、 どこからチェックすべきかは変わってくるでしょう。

Tgマウスのタンパク質発現が確認できない理由 削除/引用 No.612-1 - 2009/06/04 (木) 20:31:30 - momon いつも拝見させていただいています。 現在ある分子のTgマウスの解析をしています。 ある分子というのは、cDNA長がおよそ9kbpで現在その機能はわかっていません。ある文献では神経細胞に多く発現していて、その多くは細胞質に存在していると報告されています。 このTgマウスにはCMVプロモーター、タグ付きのcDNAを組み込んであり、ゲノムレベル、mRNAレベルでは発現を確認しております。しかし、タンパク質（ウエスタンブロット、免疫染色）では発現が確認できません。 そこで教えていただきたいのですが、mRNAの発現まで確認されながらタンパク質で検出ができない場合、どのようなことが考えられるのでしょうか？ Tgマウスでこのようなことが起こるのはよくあることなのでしょうか？ よろしくお願いします。

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