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通りがかりさん、Ｃさんありがとうございます。 削除/引用 No.612-26 - 2009/06/09 (火) 13:03:21 - momon 通りがかりさんありがとうございます。 おっしゃる通りで、ノンスペの中にバンドが隠れている可能性はあるかもしれません。 目的タンパクに対する抗体ではTgとNon Tgで差は見られませんでした。 やはり今の状態で行動実験をするのは厳しいですよね。 Cさんありがとうございます。 脳のタンパクライセートは嗅球、大脳皮質、小脳、脳幹などに切り分けて検討しました。 また発現細胞はニューロンドミナントだといわれています。

(無題) 削除/引用 No.612-25 - 2009/06/08 (月) 19:47:04 - C 脳もいろいろで、部域により発現の程度がけっこう違うとかは珍しくないから、そういうやつをホールブレインで見たりすると、発現が強くないやつだと特に、見えなくなってあれ全然発現してないですよとかおもうときあるから部位に分けてしらべたほうがいいというか脳のときはそうしてる。やってるとやっぱ脳は筋肉とか肝臓とかとはけっこう事情がちがう感じがすごいする。でもいきなりウェスタンだと部位別に切り出すのが面倒だし慣れないと原型とどめなくなるから、はじめは、全脳をいくつかの角度で切って切片作って組織染色してみるとか、脳半分に切ってニトロセルロース膜とかに判子見たくポンと押して免疫染色とか（これはじぶんではやった事無いけどやったという人の話を前に聞いた。）してまずチェックしてみたらどうでしょうか。 あと神経細胞で発現してるということなのでニューロンでということでいいでしょうか。グリア細胞関係の細胞とかではないといことでOKでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.612-24 - 2009/06/08 (月) 12:40:22 - 通りがかり > TgマウスとNonTgマウスでN末端側、C末端側などの様々な抗体を使いウエスタンにて比較しましたが、Tgマウスに特異的なバンドは見られませんでした。 これはタグ抗体を使っての話でしょうか？「様々な抗体」というのがよく分かりませんが。 バックが盛大に出るような状況で比較して特異的なバンドが見当たらなくても、バックに隠れてるのかもしれないし、何とも言えないのでは？ 目的蛋白に対する抗体はワークするようなので、単にその抗体で Tg と WT を比較すればいいのではないですか？ これで明らかにバンドが濃くなっているくらいでないと、行動実験などをする意味がないと思いますが。

###さんありがとうございます。 削除/引用 No.612-23 - 2009/06/08 (月) 12:00:44 - momon Cangetsignal、またECL advanceなどで検出感度を上げて検討しましたが、やはりダメでした。

(無題) 削除/引用 No.612-22 - 2009/06/08 (月) 11:49:20 - ### >[Re:21] momonさんは書きました : > この条件で、上記の精巣で発現しているタンパクや細胞強発現系でのタンパクも検出出来ています。 ということは精巣でのTransgeneの発現は確認できているので、Tgの系はワークしているが、脳でのタンパク質発現は確認できないということですね。 そうすると脳でのTransgeneの発現がWBでの検出限界以下になっているということでしょうか。大きいタンパク質ですのでトランスファーの改善も必要かと思いますが、WBの検出感度を上げる為に例えばCangetsignal(TOYOBO)の様なものを用いられてはいかがでしょうか？

###さん、おおさん、ありがとうございます。 削除/引用 No.612-21 - 2009/06/08 (月) 10:36:04 - momon ###さんありがとうございます。 RNAはTg特異的なmRNAとして検出出来てます。 Transgeneの比率ですが、Non-Tgでは0ですので比率では表せないです。 ただEndogeneと比べて半分以下だと思われます。 おおさんありがとうございます。 ES細胞時点ではおそらく確認していないです。 おおさんのおっしゃる神経の初代培養からのアプローチは現在検討中です。これでダメならあきらめようかなと思っています。 脳以外でのタンパク発現ですが、精巣で発現しています。しかし、Tgマウスの精巣でTransgeneが発現することはよくあることと聞いています。もちろんこのタンパクを精製して扱うことなどはできると思いますが、できれば行動実験などをしてTg特異的な差を出したいと思ってます。 各フラクションに分けて検出する方法も検討しましたが、やはりダメでした。 ウエスタンに関わる実験条件ですが、ATTOさんのeパジェル、5-20%と6%のゲルを使っています。高分子量はウエットの方がいいというのは知ってますが、セミウエスタンで1.28mA/cm*cm、120minの条件でブロットしています。 この条件で、上記の精巣で発現しているタンパクや細胞強発現系でのタンパクも検出出来ています。

(無題) 削除/引用 No.612-20 - 2009/06/07 (日) 19:30:36 - おお あ、9kbあるって書いてますね。タンパクは300kDaくらいですか。 トランスファーとかも若干難しい大きさですね。ゲルの%とか トランスファーの条件いかがなもんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.612-19 - 2009/06/07 (日) 19:03:30 - おお ちょっと気になっていたのですが、TgのもとであるESでは ウエスタンで発現がみとめられたのでしょうか? 神経細胞で発現しているんですよねたしか。 そうするとTgから、神経細胞のプライマリーを得た場合はどうでしょうか? タンパクは脳組織から抽出してますよね。ほかに発現している場所がある 場合、その場所でも検出できないでしょうか? タンパク量は1レーンどれくらい乗せているでしょうか? 細胞質にプレドミナントということだったと思いますが、 タンパクを抽出する時、細胞質のタンパクをとって、 核などのフラクションと分けてしまえば感度が上がる可能性が あります。 あるいはうまく抽出できていないとか、、、 無理やりバーシャルに精製してしまうという裏技もあります。 その類の方法で一番簡便なのはIPです。 >このようなtransgene-タンパク質の検出ができないマウスで行動実験、薬剤抵抗性などの実験をするのはやはり無謀でしょうか？ 無謀とまではいいませんが。RTでエンドの半分でそれがタンパク になっているのであれば、何らかの影響が出る可能せいは 幾らかあると思います。 今のところの問題は、その発現を示すデーターが取れていない ということだと思いますが、、、、 動実験、薬剤抵抗性などの実験どれほどの手間と時間を考えていますか? プレリミなリーでとって進めるかどうか決めるのにどれくらい ようするのかなあって思ってます。 健闘をお祈りします。

(無題) 削除/引用 No.612-18 - 2009/06/07 (日) 16:33:13 - ### >[Re:17] momonさんは書きました : 一つの懸念はtarget proteinの分解産物のバンドがノンスペシフィックバンドによって埋もれてしまっている可能性が想定されるかと思うのですが内在性のtarget proteinが検出される条件でTgのバンドが検出されないのであれば可能性は低そうですね。 あとはmRNAの検出系の検討でしょうか。 non-TgとTgで比較してmRNAの発現量の比率はどれくらいなのでしょうか？ あまり大きな差がないとWBで見ることは難しいでしょうね。 それからTg特異的なmRNAとして検出はされていますか？ Tagを吹かされているとの事ですのでTagを含めたprimerでTg特異的なmRNAを検出することは可能かと思いますが... 今のところ私の思いつくところはこのあたりまでです。

###さんありがとうございます。 削除/引用 No.612-17 - 2009/06/05 (金) 19:36:57 - momon 分解産物ではないと判断している理由ですが、まずはじめにタグに対する抗体をＢ６マウスに反応させてもノンスペのバンドを検出してしまいます。 ちなみにタグはV5タグです。 内在性の目的分子は市販の抗目的分子抗体で、予想される全長の分子量で検出できます。 TgマウスとNonTgマウスでN末端側、C末端側などの様々な抗体を使いウエスタンにて比較しましたが、Tgマウスに特異的なバンドは見られませんでした。 また、様々な組み合わせで免疫沈降しましたが、Tgマウス特異的なバンドは得られませんでした。 分解されているにしろ、とにかくTgマウスとNonTgマウスを比較して違うバンドを検出しようとしましたが検出できませんでした。

中年さんありがとうございます。 削除/引用 No.612-16 - 2009/06/05 (金) 19:17:58 - momon よかったです。初めからそんなにやらなくてはいけないのかと思いました。

(無題) 削除/引用 No.612-15 - 2009/06/05 (金) 18:57:59 - ### >[Re:6] momonさんは書きました : > 目的たんぱく質はウエスタンブロットで検出していますが、タグに対する交代を使用しても、ものすごいノンスペが出てしまいます。 これ気になりますね。 分解の可能性はないということですがどういった結果からそのように判断されているのでしょうか？ 今までの経験から、組織にもよりますが培養細胞よりも組織の方がプロテアーゼ含有量が高いので分解されやすいように思います。

(無題) 削除/引用 No.612-14 - 2009/06/05 (金) 18:38:57 - 中年 あくまで「場合によっては」なので、最初からそんなにチェックする訳じゃないです。最初のインジェクションでだめだったら腹を括って沢山やるかなという感じ。

中年さんありがとうございます。 削除/引用 No.612-13 - 2009/06/05 (金) 00:10:01 - momon 数十ラインですか！？ Southernポジティブだったのは７ラインぐらいでした。。。 やはり初めにたくさん作るべきだったんですね。

(無題) 削除/引用 No.612-12 - 2009/06/04 (木) 23:28:36 - 中年 Tgマウスを何ラインくらいチェックされたか分かりませんが、しっかり発現が認められるようなラインを取るためには、場合によってはSouthernでポジティブなものをwesternでは数十はスクリーニングする必要がありますよ。

み さんありがとうございます。 削除/引用 No.612-11 - 2009/06/04 (木) 23:18:54 - momon 発現量の低いタンパク質を扱うのは初めてです。というよりこのテーマが最初のテーマなので正直判断が難しく困っています。 個人的な話ですがタイムリミットもあるので、残された時間で形できることをするために、引き際も大事だと思っています。 今回のアドバイスを含めてボスと話しあってみます。

(無題) 削除/引用 No.612-10 - 2009/06/04 (木) 23:04:34 - み >[Re:3] momonさんは書きました : > Tgマウスの作製前に腎臓由来細胞（HEK293）、神経由来細胞（SHSY5Y）を用いたタンパク質過剰発現モデルでタンパク質の確認条件などはクリアしております。 抗体は問題ないということでしょ。 （強制発現とTgマウス組織での発現量は雲泥の差といえど） でも非特異がいっぱい出るとお聞きして、組織抽出から検出までの工程がそれほど最適化されていない気がしますね。 ある程度発現量の低い組織蛋白を扱った経験はおありでしょうか？ 御自分の中にその辺りの標準（指標）が備わっていれば今回の件も、どこまでやれば悔いは残らないかの判断はできるでしょう。 経験が備わっていない人なら、抽出から検出までの工程を上手い人に教わるのが一番早いでしょうが。

atsさんありがとうございます。 削除/引用 No.612-9 - 2009/06/04 (木) 22:48:07 - momon たしかによい抗体ありきの実験なので様々な抗体を試しましたが、これというものは見つかりませんでした。 抗体の精製にも問題はないと思います。 分解産物の可能性も検討しましたが、おそらくその可能性はないと思います。 うーん、難しいです。。。

atsさんありがとうございます。 削除/引用 No.612-8 - 2009/06/04 (木) 22:38:53 - momon CMVプロモーターが不活性化されやすいというのははじめて聞きました。文献を探してみます。 mRNAはRT-PCR、real time PCRで確認しました。 また、検出しているPCR産物がゲノム由来でないことも確認しました。プライマーもイントロンを挟んでいるので大丈夫です。 Real time PCRの結果、transgeneはendgeneの半分ほどだと思われます。 やはり単純に量が少ないのでしょうか。。。

(無題) 削除/引用 No.612-7 - 2009/06/04 (木) 22:37:50 - ats まともに使える抗体（条件）を用意することが先決でしょう。 タグに対する抗体もaffinity精製してあるものでしょうか？ ノンスペは分解産物を検出している可能性はないですか？Tgではない正常マウスでもバンドが検出されると言うことですね。

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