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(無題) 削除/引用 No.606-5 - 2009/06/06 (土) 16:38:32 - C 精製した蛋白質にチューブリンがたくさんコンタミしてるという事はよく考えるとなんか矛盾する文章という気がするのですが、どのようにして精製したのでしょうか？この精製というのは、単にタグとかでつけてアフィニティーカラムで調べたいものをエンリッチしたという意味でしょうか。それとも、カラム何本か通すとかしてちゃんと精製したのにチューブリンがいっぱいということでしょうか。 前者なら解決の第一選択として2-DPAGEが考えられますが、尿素や界面活性剤で可溶化できてかつpI的にゲルにうまく収まる蛋白質でないと難しいですね。2-Dというとよく本とかで網羅的な解析とか書いてあるのでなんかなんでもOKっぽい感じするけど、やってみると分かるけど可溶性とかpIとか分子量とかゲルストリップへの浸透とか、いろいろハードルがあって、結構ゲルに入らない蛋白質はあります。pI8.5超えるような塩基性蛋白質や100KDa以上の高分子量蛋白質はしばしば難しい。特に膜蛋白質とかはゲルに全然入ってない事が多い。 あとtubulinと直接オア間接に結合してる可能性もありますね。細胞骨格はいろんなのとインターラクショんしてるから。これだと芋ずる式にいろんな蛋白質を連れてきてしまうので、その時は精製過程で変性処理を入れてみるのもいいかもしれません。TAPtagやってるならtagのひとつをHisとかSタグにするとか、protein Atagなら変性条件にさらしてもふつうのbufferにもどせば再生してIgGカラムに結合するし。変性条件いれると少し回収率下がるけどコンタミナントはけっこう減ります。

(無題) 削除/引用 No.606-4 - 2009/06/04 (木) 15:29:57 - おお どのようにサンプルを得ているのか分からないので 助けになるか分かりませんが、、、 微小管がが安定した状態でタンパクを抽出すれば いいかもと思いました。ライシスバッファーに タキソール加えるとか、、、たしかグリセロール も微小管の安定かに寄与しているんじゃなかったっけ。

(無題) 削除/引用 No.606-3 - 2009/06/04 (木) 09:57:21 - ~ 質量分析であれば、それほどの量はいりませんよね。 2D-PAGEではだめでしょうか？ pIさえ異なれば分離できると思いますが。 http://proteome.tmig.or.jp/2D/Fibro/humfb_menu.html では、特に55kDa辺りがチューブリンでつぶれているようには見えませんので、 材料によるかもしれませんが、この方法は参考になるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.606-2 - 2009/06/04 (木) 09:28:41 - AP バンドといっているから、一次元で分離しているのでしょう。 二次元電気泳動で分離できたりしませんか。

beta-tubulinの除去 削除/引用 No.606-1 - 2009/06/04 (木) 07:46:52 - ms 培養細胞で発現させたタンパク質を精製して，質量分析で解析しています． 目的のバンドが55kD付近なのですが，beta-tubulinが大量にコンタミしており，解析が困難です． どなたか，tubulinの除き方をご存じないでしょうか？ TAP精製も試したのですが収量が悪く，目的のタンパクが検出できませんでした．

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