全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.593-7 - 2009/06/06 (土) 11:45:05 - ショーン おおさん　 ありがとうございます！！ pHを上下に４点程ふったところpHが高い方がよいことが分かりました！！ 他にもMgCl濃度やNaCl濃度、グリセロールの有無も検討したのですが、 pHの変化が一番効果的に見えました！！ （NaClは入れたほうが良かったです） 本当にありがとうございます！！ 早速　本番で精製します！！

(無題) 削除/引用 No.593-6 - 2009/06/03 (水) 17:12:18 - おお >[Re:5] ショーンさんは書きました : > > それとpIのことですが、 > ネットのソフトを使い調べてみたところ、 > 理論値でpIが 8.07になりました！ > 今まで使っていたbufferはpH=8.0で、 > 20mMのTrisを使用したときは8.0よりも高めでした。 > おおさんの言われているようにpI付近だったため、可溶化しにかったものが > pHの変化で少しだけ可溶化されたように見えているのかもしれないので > pHを8.0前後でふってみたいと思います > （ついでにNaClの有無でも） 実験をする余裕という意味で許容範囲ないでできるならpHをふってみればと思った次第です。 構造をやっていた、ひとはこれを理論値でチェックしてpIから 1以上離すようにしていました。ほんというと理論はあてにならない とおもうので、WEBツールで調べろというのはわざとかかなかった のですが(というのは折りたたまれかたとか立体的な制約でかなり 変わる可能性があるので)、目安にしてもいいかもしれません。 次のイオン交換が陽か陰でpHを上にふるか、下に振るか決心が つくかもですね。ま、薄める時pHを変えるというてもあります のでそんなにこだわる必要もないでしょうけど。 お書になった内容からすると上げた方がいいかもですね。

(無題) 削除/引用 No.593-5 - 2009/06/02 (火) 20:01:58 - ショーン おおさん　ありがとうございます！！ 次の段階はイオン交換を考えていました！ 塩濃度を薄めるのに溶液量を増やすことに　気持ち的に抵抗があったので 塩を入れないようにしていましたが、 次から塩を入れてみようと思います！！ それとpIのことですが、 ネットのソフトを使い調べてみたところ、 理論値でpIが 8.07になりました！ 今まで使っていたbufferはpH=8.0で、 20mMのTrisを使用したときは8.0よりも高めでした。 おおさんの言われているようにpI付近だったため、可溶化しにかったものが pHの変化で少しだけ可溶化されたように見えているのかもしれないので pHを8.0前後でふってみたいと思います （ついでにNaClの有無でも） 本当にありがとうございます！！

(無題) 削除/引用 No.593-4 - 2009/06/02 (火) 16:36:21 - おお 塩は入れた方がいいと私も思います。100mMくらいのNa+かK+でしょうか。最低でも50mM リゾチウムで菌を壊すという手もとれますね。次の段階はイオン交換をお考えでしょうか? イオン交換って結構融通がきいて、塩濃度が高ければ薄めてしまえばいい ので、あまりイオン交換の前のステップの塩濃度で私はあまり悩まないです。 んそれともハップかヘパリン?それでもたいさないですね。 あなたの扱っているタンパクのネイティブの状態のpIは多分検討がつかない と思いますが、ライセいとのバッファーのpHに近いと解けにくい可能性が あるという意見もありますので、pHを工夫して溶出がうまく行くように なることもあり得ます。ただ劇的に変わらないことの方が多いかと思いますが。 TRISの量を減らして溶出がうまく行ったというのが正しい観察であれば、 もしかしたら、バッファー効果が強くなくなったことでpHがぶれたため という見方もあるかなあとちょっと思いましたが、、、、そんなことは ないかも

(無題) 削除/引用 No.593-3 - 2009/06/02 (火) 15:25:49 - ショーン みさん　ありがとうございます 破砕状態の善し悪しは確かに言えると思います 一応　同じ日にタイマーを使い できるだけ同じ破砕条件で、何種類かBuffer条件を試みたのですが.... その差も劇的に増えた！！という感じではないのでなんともいえません Bufferの組成は他にEDTAとMgCl2、グリセロール、プロテアーゼ阻害剤それとGDPが含まれます。塩は後々の精製ステップの関係上いれていなかったのですが、回収率を考えると入れてみてみようかとも考えています 誘導条件は一応　精製する前に、検討をしたのですが どの条件下でも可溶性よりも不溶性に目的蛋白質がありました タグを変えてみたりもしたのですが　GSTタグを使うことになりました freeze and thawの回数、ホスト変更は試してみたいと思います！！ ありがとうございます

(無題) 削除/引用 No.593-2 - 2009/06/02 (火) 11:23:40 - み 50を20に変えたことが原因とは思えません。 破砕状態がたまたま後者で良かったのでは？実験誤差？ 塩など他に何も入れられていないのでしょうか。 質問の域を超えた蛇足ですが、過去ログにもたくさんあるように、buffer組成の検討以外にも可溶化を試みる方法はあります。蛋白誘導条件、freeze and thawの回数、ホスト変更など。

タンパク質精製 削除/引用 No.593-1 - 2009/06/02 (火) 09:40:13 - ショーン 今低分子量Gタンパク質の精製をしています 大腸菌を使って発現させており、 破砕する際のBufferはTris-HCl(pH 7.5)を現在50ｍMで使用していました。 しかし、不溶性画分に目的タンパク質が多く、 改善を試みようとBuffer条件を検討したところ、 Tris-HCl濃度を20ｍMまでさげると可溶性画分に移行しているようにみえました。 Tris-HCl濃度を下げることで何か影響がみられることがありますか？ 教えてください よろしくお願いいたします

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---