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(無題) 削除/引用 No.592-12 - 2009/06/18 (木) 09:27:41 - SIRT1 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.592-11 - 2009/06/17 (水) 21:10:05 - C 遺伝子でも蛋白質でもそれらを直接細胞に振りかけただけでは、容易に細胞内に取り込まれることは期待できないと思います。トランスフェクション試薬や、既に紹介されているような蛋白質導入のための特別な試薬などが必要になりますし、それらを用いても、ものによってはなかなか効率よく導入出来ない場合も少なくありません。また導入された場合でも実験はその蛋白質が分解されていく前に行う必要がありますし、外から導入した蛋白質が生理的なものと同じコンパートメントに分布するかどうか、細胞内で活性を維持しているかどうかもチェックが必要でしょう。 化学的に合成した化合物の場合、疎水性が高いものは細胞膜を拡散で容易に通過していくでしょうが、荷電のあるようなものだと、なにか膜のトランスポーターをうまく使って積極的に取り込まれない限り、細胞内に取り込まれる可能性は低いでしょう。 化学的に合成した化合物としての阻害剤を細胞にかけて、効果を調べる実験はしばしば見受けられますが、特異性の問題はいつもつきまといます。意図する酵素なり蛋白質に作用してなんらかの結果が得られたとしても、その酵素だけに特異的に働いた結果なのかどうか分からないような気がします。創薬や有機化学の素養のあるひとだと構造式を確認して起こりうるいろいろな可能性を考える事が出来ますが、そうでない場合は-----特異的インヒビターという言葉には慎重になった方がいいような気がします。レビュアーがそうした事に注意を払っていない人ならば論文は通るかもしれませんが、その論文が結果を正しく解釈しているかどうかは別とおもいます。

さらに質問です。 削除/引用 No.592-10 - 2009/06/17 (水) 15:20:02 - SIRT1 厳しいご指摘ありがとうございます。この蛋白がNAD-dependentであることや活性化するのかなどの問題は当然あると思います。 　ところで、いくつかのご指摘のなかで阻害剤や活性化因子を直接細胞に導入して意味があるのかという指摘に質問があります。世の中には、それほどmajor jorunalではないにせよＭＡＰＫ阻害剤やＮＦｋＢ−Ｄｅｃｏｙなど細胞内シグナル伝達や核転写因子などターゲットにした蛋白なり遺伝子を細胞に振りかける実験が論文として採用されてますけど、これらの研究についてはどのように判断すればいいのでしょうか？ ＮＦｋＢ−Ｄｅｃｏｙは、アトピー性皮膚炎患者に軟膏として直接外用することで効果を発揮するようですし、細胞や組織の環境が整えば蛋白や遺伝子が取り込まれて薬理作用を発揮すると思うのですが、

(無題) 削除/引用 No.592-9 - 2009/06/04 (木) 17:17:17 - おお >[Re:1] SIRT1さんは書きました : > いつも勉強させて頂いています。 > 経験ある皆さんに教えて頂きたいことがあります。SIRT1に関する実験をしていますが、SIRT1のactivator や　inhibitorを用いてSIRT1の役割について研究したものはよく見られますが、ここでrecombinat SIRT1を用いて（培養細胞に直接添加して）、その役割を考察した論文は見当たりません。直接SIRT１を用いた方が手っ取り早いと思いますが、如何なものでしょうか？ > 核転写制御因子ですから細胞膜に受容体はありませんが、培養細胞に直接添加すれば、幾らかは細胞内に取り込まれて作用するだろうと思うのです。如何なものでしょうか？研究素人です、何でも結構ですのでご指導お願いします。 直接細胞にほりこむのはちょっと難しいと思います。 細胞に取り込ませる試薬をつかうか、エレクトロポレーション などでないと細胞質へ入りにくいとおもえます。 そうでなければ取り込んでもエンドソームの中とか はいってもほんとに必要なところにいるのか とも思えますし、入ったことの検証もそれなりにやらないと 行けないでしょうから、、、、(細胞に細胞質や核で作用するものを ふりかけて入れる実験は確かにありますけどね)。 細胞膜をタンパク質みたいな大きな物が通過するというのは 以外と難しいわけです(その割にはDNAを導入する技術は 確立してしまっているのですけど)。 まあ、欠点などはほとんどもう指摘があります。 手技的には過剰発現やノックダウンとかのほうが、どういうわけか 直接タンパクを入れるより確立していますので、そういう方法で やる方が多いかと思います。

(無題) 削除/引用 No.592-8 - 2009/06/03 (水) 22:03:42 - C 頭から否定はしない。ただいける可能性はかもしれないけど、全部の細胞に導入されないし、導入した蛋白質もしばらくすれば分解されてしまうし、細胞も分裂していくしで、細胞の中に入れた量がそのままとどまって働きつづける訳じゃないから、短時間で何か見るなら可能性あるかもしれないけど、ある程度時間かける実験ならあまり賢い選択じゃない気する。そもそも、活性あるリコンビナントをゲットできるかどうかもわからないし。まだトランジエントとかの方がましかも。ステーブル作ればいいかもしれない。でも発現量を内在性のものに合わせてコントロールできるようにするとか、、適切な発現量のクローン選ぶとかがしんどいかも。抑えるならRNAiとかいいかも。あんまりこの蛋白質よく知らないけど、この酵素はdeacetylationのときにNAD使いますねたしか。蛋白質導入にしろ、強制発現にしろ、もしこんなものが必要以上にたくさん働きまくったら、細胞内レドックス状態は大変な事になって大丈夫かなあ、とかも思います。仮におもしろい結果がでても本当に期待する出来事から生じたのか、無理なことしたことで起きた２次的な何かなのかよくわからなくなるし。 たしかにSIRT1に限らずよく化合物のインヒビターやアクチベーター細胞にかけてる論文とかあるけど、それってほんとにところどこに効いてるのか分からないとおもう。こういう実験するひとはそのあたりどうやって確認してるのかなあと時々思う。

(無題) 削除/引用 No.592-7 - 2009/06/03 (水) 20:42:01 - In+vivo,+In+vitro+ ふつうは以下のような試薬を使いますね。 タンパク質導入試薬 Pro-DeliverIN 脂質ベースのタンパク質導入試薬です。静電気的かつ疎水的にタンパク質と結合し，タンパク質の機能を維持したまま細胞内へ導入できます。タンパク質の機能解析，細胞内局在解析など，新たな分子機構の解明に有用です。

反論覚悟です 削除/引用 No.592-5 - 2009/06/03 (水) 15:00:45 - ピペド おっしゃるとおり、そういうところから大発見につながることも万に一つはあることは、さまざまな事例が示しています。しかし万に一つを期待してこういう実験をやりますか？こういうのを豊かな発想と許容するおおらかさは、少なくとも私にはありません。 質問者の方は明らかに基本的な知識が欠如しています。無知と型破りは別物だと思います。

そういうところから 削除/引用 No.592-4 - 2009/06/02 (火) 10:10:48 - ami 大発見につながることもあるから、そういう実験をやることを否定はしない、というおおらかなボスについていました、以前は。

(無題) 削除/引用 No.592-3 - 2009/06/02 (火) 02:27:34 - あべちゃん iPS細胞も、ウイルスではなく、蛋白質を直接打ち込むことで、誘導できるらしいので、 sirtuin蛋白質を直接、導入するのも可能だと思いますが、 しかし、 たしか、この蛋白質ってNAD-dependentでしたよね。 ただ蛋白質が存在するだけではなく、細胞内のエネルギーレベルが変化しないと活性が変化しないと思うので、阻害剤や活性化因子を加えるんじゃないですか？

本気ですか？ 削除/引用 No.592-2 - 2009/06/02 (火) 01:04:44 - ピペド 発現ベクターでなくて、組み換えタンパクを添加するのですか？ 実験に取り掛かる前に、生物学一般の知識は大丈夫ですか？

recombinant SIRT1について 削除/引用 No.592-1 - 2009/06/02 (火) 00:34:38 - SIRT1 いつも勉強させて頂いています。 経験ある皆さんに教えて頂きたいことがあります。SIRT1に関する実験をしていますが、SIRT1のactivator や　inhibitorを用いてSIRT1の役割について研究したものはよく見られますが、ここでrecombinat SIRT1を用いて（培養細胞に直接添加して）、その役割を考察した論文は見当たりません。直接SIRT１を用いた方が手っ取り早いと思いますが、如何なものでしょうか？ 核転写制御因子ですから細胞膜に受容体はありませんが、培養細胞に直接添加すれば、幾らかは細胞内に取り込まれて作用するだろうと思うのです。如何なものでしょうか？研究素人です、何でも結構ですのでご指導お願いします。

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