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(無題) 削除/引用 No.586-20 - 2009/06/03 (水) 09:47:23 - あべちゃん >[Re:18] かわさきさんは書きました : > 笑い男さまが教えてくださったものと同じものでした。結構このシステム有名なんですねえ。invitrogenのカタログは電話帳より分厚いので、暇な時間であっても読む気にはなかなかなれないです。まずもってベクターの多いこと。微妙に仕様が違う商品が並んでいて、違いを理解することができず、いつもアカデミックサポートに電話してます。 あっ、笑い男さん、すみません。 そういえば、去年の末、invitrogenの営業の人がこのキットのお試し品をくれました。 invitrogenの営業の人に聞いてみると、まだ4回分くらいの試供品が残ってるかもしれませんよ。

(無題) 削除/引用 No.586-19 - 2009/06/02 (火) 20:59:13 - 貫 ＞貫さま、おおさまもペプチド合成を勧めておられます 微妙なところなのですが補足します。ペプチド合成ですとアグリゲートになり溶けない可能性が高いので、わたしはあまりお勧めできません。私なら、Invitrogenの系に飛びつきますが、、、。

ありがとうございます。 削除/引用 No.586-18 - 2009/06/02 (火) 20:32:26 - かわさき あべちゃんさま。ありがとうございます。 ＞膜蛋白質なら、 http://www.invitrogen.co.jp/proteomics/MembraneMax.shtml このようなin vitro翻訳のシステムもあります。 笑い男さまが教えてくださったものと同じものでした。結構このシステム有名なんですねえ。invitrogenのカタログは電話帳より分厚いので、暇な時間であっても読む気にはなかなかなれないです。まずもってベクターの多いこと。微妙に仕様が違う商品が並んでいて、違いを理解することができず、いつもアカデミックサポートに電話してます。

ありがとうございます。 削除/引用 No.586-17 - 2009/06/02 (火) 20:28:07 - かわさき APさま。ありがとうございます。 ＞膜貫通ドメインだけ、あるいはプラスいくらかのアミノ酸残基なら、ちょうど合成ペプチドにちょうどよい長さだと思いますが、それではだめですか？　大腸菌で発現するのは難しくても、in vitro飜訳系でとれるかもしれません。 そうですね。貫さま、おおさまもペプチド合成を勧めておられます。多分それが正解なのでしょう。in vitro翻訳系は・・・、今まで収量がよかった経験がないもので・・・。RIでやっとシグナルがでる程度しか・・・。きっと下手なんでしょうねえ。 ＞主に生理作用や薬理作用をもつ分子をスクリーニングして探す目的で、多様な配列をもった合成ペプチドライブラリーがあったりしますが、そのなかには培地にくわえるだけでも細胞膜にはまりこむものや、膜に穴をあけるものもありますし、エンドサイトーシスで取り込まれるものもあります。 これこれ！この話です。聞きたかった話は。やはり加えるだけで膜に行くやつがいるんですね！ミセル化みたいなことしなくても。すっごく面白いです。 ＞また、大腸菌で発現したチャンネルタンパク質を人工脂質二重膜にインテグレートした状態で再構成したり、これをアッセイ用の膜支持体に融合させてチャンネルのアッセイを行ったりする方法も、その方面ではポピュラーなようです。 すでに確立した方法でもあるわけですね。笑い男さまが教えてくださったinvitrogenのやつも多分その類ですね。思ったよりも結構すすんでいるんですね。勉強になります。 ＞そういうことも考えれば、質問者さんのアイデアは決して荒唐無稽なことではなく、なんか半端な知識で頭ごなしに否定したり見下したしたりするコメントは、かえって頭悪そうに見えます。最近、そういう書き込みが多くないですか（ハンドル名がpunctuationのひととか）。 いやいや本当に思いつきだったんです。今この件に関しどのくらいまで進んでいるかなんてまったく把握するまえにとりあえず皆様にお聞きしてみようとと甘えてみただけなんです。反論は議論にはつき物ですから・・・。いろんな意見があって、よく見ていくといくつかは共通していて、だんだんとおぼろげながら正しそうなことが見えてくる。議論とはそんなものだと思っています。（森羅万象に優れていてほぼ正しいことばかりを教えて下さるスーパーマンもこのフォーラムには確かに何人かおられますねえ。）ただ明らかに攻撃的なものはちょっと・・・。実のところ、最初はちょっと凹みました。

ありがとうございます。 削除/引用 No.586-16 - 2009/06/02 (火) 20:05:46 - かわさき おおさま。ありがとうございます。 ＞まず疎水性の強い膜貫通ドメインを発現するのは難しい場合が多いとおもいます。 もしかしたら、インクルージョンボディーを形成してドバっと発現する可能性は 残っているかもしれません。 やはり大腸菌での膜貫通ドメインの作成は難がありそうですね。貫さまも同意見ですし、おそらくそれが正しいのでしょう。 ＞疎水性の強い膜貫通ドメインでしたら、細胞膜にもしかしたら潜り込んでくれるかも とおもいます。たとえばBclファミリーは細胞質で合成されて、細胞膜に移行して 膜貫通ドメインを挿入するような挙動をしめします。 ですから、濃い濃度で精製できて細胞にかける時界面活性剤を無視できるほど少量で いいなら、そのままかけても望みがあるかもしれません。 通りがかりさまもおっしゃっていますが、単純に振り掛けるだけで勝手に膜にもぐりこむようなペプチドも実際にあるんですね。メカニズムとかすごく面白そうです。このような話が一番聞きたかったんです！ 恐らくタンパクは自分の周りの環境（水か油か）に応じて熱エネルギー的にもっとも安定な状態に確率的・動的にシフトすることができるのでしょう。また疎水性といっても水にまったく溶けないわけではなく、油水分配係数に従って動的平衡の状態にあると思われます。ですから起こっている現象は思っているよりももっと複雑かつ動的なものなのかも知れませんね。 界面活性剤の濃度は実験臨床を問わず確かにクリティカルな問題です。塩化ベンザルコニウムは実際に点眼剤に使用されており、低濃度であれば臨床でも何とか使用可能な薬剤です。 ＞膜に挿入したいならもしかしたらトポロジーが問題になるかもしれませんね。たいていの場合は 膜貫通するヘリックすの近傍のアミノ酸の電荷で決まることがおおいようです(生理的に合成された ときは)。 そうですね。機能を持たせる以上トポロジーは重要かも知れません。もしランダムならある程度の確率で具合良いものもあるはずなので目的は果たせるかも知れませんが、すべてが悪い方向だと望外の結果になりますね。近傍のアミノ酸の電荷で決まるそうなので（すいません不勉強で知りませんでした。）、膜貫通プラスアルファで良さそうですね。 ＞膜貫通ドメインだけであれば20アミノ酸ぐらいですよね。場合によっては合成ペプチドでも いいのではないかと思ったりもしますが、、、抗体作成に使うほど必要な実験には ならないかもしれないので、思ったより高くつかないかもしれませんよ。 そうですね。スケールの問題は今のところさっぱりわかりません。でもおっしゃるように実験レベルならそれほどは要らない気がしますね。実際に臨床となるとどうかわかりませんが・・・。 ＞あとはプラスミドで細胞発現ベクターをトランスフェクションして、発現させる 系を使わないのは何か理由がありますか? 下でも書かせていただきましたが、臨床で治療に使えないかなというのが一番の理由です。レンチで目的の遺伝子の野生型を発現する系ももうあるのですが、遺伝子導入はまだまだ臨床では風当たりが強くて・・・。実験目的だけならプラスミドで発現する系で十分ですね。 皆様の有益なコメントのおかげで思いつきだけのものがだんだんと可能性あるんじゃないかと思えてきました。本当にうれしいです。このフォーラムはすばらしいです。分野を越えた仲間たちと食堂でばったり出会ってそこで長年抱えていた問題がいきなり解決したというような話をよく聞きますが、このフォーラムはまさにそんな感じのすばらしい場所です。

(無題) 削除/引用 No.586-15 - 2009/06/02 (火) 19:36:55 - かわさき 貫さま。ありがとうございます。 ＞非常にむずかしいと思います。とくに大腸菌は外来疎水領域を嫌います。（死にますか、ほとんど発現しないか） もし、とても重要なら、しっかりデザインして、だめなこともあることを念頭に置いておいてください。 手っ取り早いのは、ペプチド合成ですが、、、水溶液にはふつうとけません。DMSO他の有機溶媒でどうなるか？は知りません。 そうですよね。大腸菌は疎水性配列嫌いますもんね。アミノ酸は２２残基なので、ペプチド合成が良さそうですね。おおさまも同意見ですし。 実は変異導入実験（私がやったわけではないのですが）にてこの遺伝子の膜貫通ドメインの中でAxxxGモチーフ（xは任意）が重要（すくなくとも必須）であることがわかっています。このたった５残基だけで十分とは思えませんので（RGDモチーフみたいに３残基で必要十分なケースもありますが・・・）、恐らくその周りの数残基も必要ではと考えています。この遺伝子を発現しない細胞（もしくはノックダウンした細胞）でいろいろなdeletion mutantを強制発現させる系で必要十分な配列を探すということも考えていたのですが、20残基ならペプチド合成十分可能ですもんね。 １の質問に関してはペプチド合成の方が期待できるという結論で良さそうですね。

ありがとうございます。 削除/引用 No.586-14 - 2009/06/02 (火) 19:19:14 - かわさき 笑い男さま。ありがとうございます。 invitrogenのこのIVTシステムは大腸菌抽出液による転写・翻訳と特殊な膜構造物への挿入という変わったシステム（不勉強なだけかも知れませんが・・・）ですね。すごく面白いです。使えそうかどうか検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.586-13 - 2009/06/02 (火) 19:16:25 - あべちゃん >[Re:12] APさんは書きました : > 膜貫通ドメインだけ、あるいはプラスいくらかのアミノ酸残基なら、ちょうど合成ペプチドにちょうどよい長さだと思いますが、それではだめですか？　大腸菌で発現するのは難しくても、in vitro飜訳系でとれるかもしれません。 膜蛋白質なら、 http://www.invitrogen.co.jp/proteomics/MembraneMax.shtml このようなin vitro翻訳のシステムもあります。

(無題) 削除/引用 No.586-12 - 2009/06/02 (火) 19:02:27 - AP 膜貫通ドメインだけ、あるいはプラスいくらかのアミノ酸残基なら、ちょうど合成ペプチドにちょうどよい長さだと思いますが、それではだめですか？　大腸菌で発現するのは難しくても、in vitro飜訳系でとれるかもしれません。 主に生理作用や薬理作用をもつ分子をスクリーニングして探す目的で、多様な配列をもった合成ペプチドライブラリーがあったりしますが、そのなかには培地にくわえるだけでも細胞膜にはまりこむものや、膜に穴をあけるものもありますし、エンドサイトーシスで取り込まれるものもあります。 また、大腸菌で発現したチャンネルタンパク質を人工脂質二重膜にインテグレートした状態で再構成したり、これをアッセイ用の膜支持体に融合させてチャンネルのアッセイを行ったりする方法も、その方面ではポピュラーなようです。 そういうことも考えれば、質問者さんのアイデアは決して荒唐無稽なことではなく、なんか半端な知識で頭ごなしに否定したり見下したしたりするコメントは、かえって頭悪そうに見えます。最近、そういう書き込みが多くないですか（ハンドル名がpunctuationのひととか）。

(無題) 削除/引用 No.586-11 - 2009/06/02 (火) 16:06:13 - おお まず疎水性の強い膜貫通ドメインを発現するのは難しい場合が多いとおもいます。 もしかしたら、インクルージョンボディーを形成してドバっと発現する可能性は 残っているかもしれません。うん次第でしょうか。 インクルージョンボディーのタンパクであれば変性させて精製ということになるかも しれません。 界面活性剤存在下でなんとか沈殿しなければ、構造的にも期待できるかもしれませんね。 疎水性の強い膜貫通ドメインでしたら、細胞膜にもしかしたら潜り込んでくれるかも とおもいます。たとえばBclファミリーは細胞質で合成されて、細胞膜に移行して 膜貫通ドメインを挿入するような挙動をしめします。 ですから、濃い濃度で精製できて細胞にかける時界面活性剤を無視できるほど少量で いいなら、そのままかけても望みがあるかもしれません。 あとはリポソームなどをタンパクと混ぜて作るとか、タンパク導入用の試薬を使うか とかでしょうか。 もし膜に挿入したいのではなく、細胞の中に入れたいのであればエレクトロポレーション でもいいかもしれません。 膜に挿入したいならもしかしたらトポロジーが問題になるかもしれませんね。たいていの場合は 膜貫通するヘリックすの近傍のアミノ酸の電荷で決まることがおおいようです(生理的に合成された ときは)。ですから、HISを使うときをつけないと思った方向に向かないことがあるかも と思ったりします。 膜貫通ドメインだけであれば20アミノ酸ぐらいですよね。場合によっては合成ペプチドでも いいのではないかと思ったりもしますが、、、抗体作成に使うほど必要な実験には ならないかもしれないので、思ったより高くつかないかもしれませんよ。 あとはプラスミドで細胞発現ベクターをトランスフェクションして、発現させる 系を使わないのは何か理由がありますか? そうそうリポソームといっても結構いろいろな形態の物がありますので、それを 調べないと、あなたのイメージで細胞にたんぱく質が導入されているのと状況が 違うかもしれませんよ。

(無題) 削除/引用 No.586-10 - 2009/06/02 (火) 04:49:48 - 貫 >[Re:1] かわさきさんは書きました : > いつも勉強させてもらっています。 > １．膜貫通ドメインだけ（あるいはプラスすこしのアミノ酸）を大腸菌で発現させることは難しそうですが、可能でしょうか？ 非常にむずかしいと思います。とくに大腸菌は外来疎水領域を嫌います。（死にますか、ほとんど発現しないか） もし、とても重要なら、しっかりデザインして、だめなこともあることを念頭に置いておいてください。 手っ取り早いのは、ペプチド合成ですが、、、水溶液にはふつうとけません。DMSO他の有機溶媒でどうなるか？は知りません。

フィーリングだけで書いてます。 削除/引用 No.586-9 - 2009/06/01 (月) 22:20:32 - 笑い男 http://www.bio.toyobo.co.jp/bio01/cgi-bin/catalog_shohin_index?item=MSM-101&us_id=&us_pwd=&bun_id=&iv_trademark=MSM-1 http://www.invitrogen.co.jp/proteomics/MembraneMax.shtml でタンパク発現・精製に利用できるかもしれません。 センダイウイルスとか、fusiogenic peptideとリポソームの組み合わせとかで、細胞膜にソーティングできないだろうか？

内容に対するレスしていませんでした。 削除/引用 No.586-8 - 2009/06/01 (月) 20:42:18 - かわさき あいうえお様。すいません。内容に対するレスしていませんでした。 ＞塩化ベンザルコニウムの利用を視野に入れているということは functionalな状態の膜貫通領域を可溶化させた状態で プレップして、薬剤として利用できうるか？という臨床を意識したものでしょうか。 アイディア自体は面白いと思います。 ありがとうございます。そうなのです。一応、病気の治療で使えないかなあと思っています。 ある遺伝性疾患ではある遺伝子のloss of functionで疾患がおこることがわかっていますが、その遺伝子産物の膜貫通領域のあるモチーフが、あるタイトジャンクション関連タンパクの細胞内局在および機能に関連することが予想されています。そこでその病気においてその膜貫通領域を細胞膜に加えるようなことをしてやればそのタイトジャンクション関連タンパクの細胞内局在が正常化し、疾患治療の可能性が出てくるのではと思っています。点眼剤と言ったのは眼科領域の疾患だからなのです。 なかなか難しいとは思いますが、しばらくは可能性を模索してみたいと思います。ありがとうございました。

ありがとうございます。 削除/引用 No.586-7 - 2009/06/01 (月) 20:27:04 - かわさき あいうえお様、通りすがり様、ありがとうございました。 可能性はあるが、現時点では一般化するにはかなりの壁があるというように理解しました。もしかしたら何も考えなくともラッキーに入るかも知れませんが・・・。 通り様、レスありがとうございます。なぜか不快な思いをさせたようで、申し訳ございません。もっと勉強しますね。

(無題) 削除/引用 No.586-6 - 2009/06/01 (月) 20:06:46 - 通りがかり グラミシジンのように、外からかけたペプチドが膜に埋め込まれてイオノフォアになる例もありますから、全くあり得ないこともないでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.586-5 - 2009/06/01 (月) 19:50:04 - あいうえお 塩化ベンザルコニウムの利用を視野に入れているということは functionalな状態の膜貫通領域を可溶化させた状態で プレップして、薬剤として利用できうるか？という臨床を意識したものでしょうか。 アイディア自体は面白いと思います。いまのところ蛋白質製剤は 可溶性アゴニスト・アンタゴニストくらいなので、膜蛋白質製剤的な ものを他の人はあまり想像しがたいのでしょうか。 生産的でないコメントしかついていない気がします。 蛋白質自体をプレップすることは場合によっては可能かもしれませんが、 ハードルは高いと思います。大腸菌の脂質を完全に除去するのは難しいですし、フォールディングの関係上、酵母を使った方がよいかもしれませんね。 遺伝子発現を介さず膜蛋白製剤的なものを目指すならば、 リポソーム化して細胞に融合させるほうが現実的かもしれません。 しかし大量のリポソームがなければ、モル数の問題で フェノタイプがでにくいことも想定しなければなりません。 ちなみに現在臨床でつかわれているGCSFなどは分泌経路が発達している 哺乳類細胞をつかっているようです。まったくあたらしいことなので ハードルは高いですががんばってください。

(無題) 削除/引用 No.586-4 - 2009/06/01 (月) 19:15:27 - 通り 可能性が無いなんて誰も言えないと思いますが？ あるとも言えないでしょう？ ＞塩化ベンザルコニウムのようなものでミセル化してやれば、うまく行けばエクソで加えても膜に行ったりしないかな？なんて期待していました。 よく考えてから言ってください。 膜貫通ドメインとは、膜にそれこそ「貫通」しているのですよ？ エクソで加えたら、細胞質に漂っているだけではないですか？ ？？？ ＞エクソで加えたタンパク・ペプチドを細胞内の目的の小器官へとデリバーできる可能性 ？？？ その方法でエクソで細胞内に行ったタンパク質は、細胞内に入った時に膜で囲まれた構造を想像しているのですか？？？？ そもそも、膜にタンパク質が行かせるのが目的なのでしょう？ 塩化ベンザルコニウムだかなんだか知りませんが、 そんなことせんでも、すでにタンパク質を細胞内に導入する方法はあります。 http://www.funakoshi.co.jp/shiyaku/entry/2939.php 細胞内に入ったとして、膜に行くかどうかということと意味が違います。 だから、言ったのです。 ＞そうですね。やる気はありますね。 自分で勉強してみてください。どうやって膜タンパク質が膜に行くのかを。 話はそれからでしょ？

すいません・・・。 削除/引用 No.586-3 - 2009/06/01 (月) 18:54:39 - かわさき >１、やってみなくちゃわからない。 可能性はあるということでしょうか？ ＞２、普通の膜タンパク質がどうやって膜に行くのか？勉強する気ありますか？ そうですね。やる気はありますね。 in vivoで起こっている膜タンパクの膜輸送をそのままmimicできるとは私も考えておりません。ですので、たとえば点眼剤に一般的に含まれている塩化ベンザルコニウム（防腐剤かつ界面活性剤です）のようなものでミセル化してやれば、うまく行けばエクソで加えても膜に行ったりしないかな？なんて期待していました。細胞内に抗体を導入したりする試薬も市販されているわけですから、やり方によってはエクソで加えたタンパク・ペプチドを細胞内の目的の小器官へとデリバーできる可能性もありうるのではないかなと思ってます。そういうことが具体例としてあるかどうか、そういうことを質問したかったのです。表現がわるくて、すいませんでした・・・。

(無題) 削除/引用 No.586-2 - 2009/06/01 (月) 16:36:35 - 通り １、やってみなくちゃわからない。 ２、普通の膜タンパク質がどうやって膜に行くのか？勉強する気ありますか？

膜タンパクの膜貫通ドメインを導入 削除/引用 No.586-1 - 2009/06/01 (月) 08:45:34 - かわさき いつも勉強させてもらっています。 表題のように、ある膜タンパクの膜貫通ドメイン部分が重要な機能をもつことが予想されており、現在実験を計画中です。 もしそうであることが明らかとなった場合、その膜貫通ドメインだけを細胞に添加するような実験をしたらどうかと思いついたのですが、 １．膜貫通ドメインだけ（あるいはプラスすこしのアミノ酸）を大腸菌で発現させることは難しそうですが、可能でしょうか？ ２．膜貫通ドメインだけが抽出できたとして、これを細胞にふりかけて細胞膜に到達させることは可能でしょうか？

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