全4件 ( 1 〜 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.580-4 - 2009/05/31 (日) 10:36:41 - ~ >ＰＣＲであるタンパクの発現配列を増やしたいのですが テンプレートが何か書かれていませんね。 テンプレートが何かによってプライマーの設計や手順が変わる場合があります。 また、PCRの経験者がいないところで立ち上げるのでしたら、 どこか教員の知り合いのいるラボなどに教わりに行くことをお勧めします。 テンプレートがプラスミドであれば、30merは長めだと思います。 20mer位で、分かっている範囲で3'末端に結合する配列がプラスミド上に無いところでTm値を揃えて止めています。 20mer位では他の部分とアニールしてしまうというのであれば,30mer位まで伸ばしても仕方が無いと思っています。 また、cDNAなどから増やす場合には、 いきなり目的の部分だけを制限酵素サイトも付けて回収できる自信が無いので、 サブクローニングのときに制限酵素サイトを付けます。 (同じプライマー配列で制限酵素サイト有り無しを作って、有りで増えればそのまま、無しでしか増えなければ、クローニングしてから再度制限酵素サイト有りのプライマーでPCRします) ORFだけの回収が難しければ、UTRを含めて回収して、 後でさらに必要な部分を切り出すか、PCRで回収します。 >欲しい配列の３’と５’の末端に相補的な配列３０merに制限酵素サイトとその足場3merをつけているだけです。 それでPCRで増えれば問題は無いでしょう。 問題なのはそれで回収できない場合にどうするかで、 ステップを増やしてでも欲しい配列に近づければ、受け入れる場合はあります。 (cDNA→1つのインサートを含むプラスミドなど) >プライマーが欲しい配列と相補的でなかったら増えませんよね？あるいは、余分な配列が何塩基分か入ってしまいますよね？ 前者はその通りです。 後者は1回のPCRで終わりできないのであれば、次のステップで除ければOKと考える場合があります。 (cDNAやBACからUTRや外側の配列も含む配列を回収→目的の配列を回収など：BACはプロモーターなどの場合) クローニング→シークエンス解析→再度PCRで2,3日はかかりますが、 PCRの条件検討は何日かかるか分かりませんので、目処が立てばステップを踏むほうを選択します。 個人的には、Pfuは癖があって条件検討しないと増えにくいというイメージがあります。 酵素を買うことが出来るのであれば、LA-taq with GC buffer (GC richでなくても)をお勧めしています。 PrimeStarもいい酵素だそうです。

基本線ですが 削除/引用 No.580-3 - 2009/05/30 (土) 16:10:37 - UK プライマー設計のこだわり（ノウハウ？）は今後、PCR初心者に今後出来てくると思います。 さて、ターゲット配列の長さが分からないので、断定的なことはいえませんが、増やしたいターゲット配列・付けたい制限酵素サイトが決まっているなら、設計するプライマーは、ある程度制限されると思います。 5'-足場数mer-制限酵素サイト-kozac-ATG-ターゲット配列 3'-足場数mer-制限酵素サイト-ターゲット配列 とりあえず、このような感じでプライマー設計されてはいかかでしょうか？そして、正確性の高いKODやPfuでPCRを行って下さい。 足場の数は、PCR産物をそのまま制限酵素処理するか否かによって変わります。これについては、下記のNEBのHPをご参照下さい。 http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/cleavage_olignucleotides.asp クローニングベクターに入れてから、制限酵素で切り出すなら、足場は2,3merで良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.580-2 - 2009/05/30 (土) 15:50:12 - ばいや 人それぞれ何かしらのこだわりがあると思います。そのこだわりを書くのは難しいかと。そこは自分で勉強して、経験して固めて行ってください。 とりあえず、長さよりTm値をそろえた方がいいです。うまくPCRがかからなかっときには条件のアニーリング温度を変えたりするかと思いますが、Tm値があっていないといじくりにくいです。 どこでプライマーを作るかにもよりますが、ピンポイントの場合は仕方ないです。両端にタグを付けて余計なアミノ酸を入れたくないときなど。ただ、多少のアミノ酸が入ってもよしとするかは実験しだい。あきらめざるを得ないときはそうします。 ただ、GCリッチといってもたいていは大丈夫です。なんとかなります。 既知の配列ならよく似た配列が他にないことを確認します。 あと気をつけたいのは制限酵素サイト周辺の配列です。大腸菌でプラスミドを増やした後、メチル化してその酵素で切れなくなったってことにならないように。たまに忘れます。 最後にPCR産物の両端に制限酵素サイトをつけたいですよね。

ＰＣＲプライマーの設計 削除/引用 No.580-1 - 2009/05/30 (土) 14:40:07 - ＰＣＲ初心者 ＰＣＲ初心者です。 勉強中なのですが、わからないことが多くあります。 今、ＰＣＲであるタンパクの発現配列を増やしたいのですが、プライマーの両端に制限酵素サイトをつけようとしています。 そこで、質問です。ＧＣリッチにならない様にしたり、Ｔｍ値や特異的プライマーを作れるように配慮するべきことは多いと思うのですが、具体的にはどうすればいいのですか？私は、欲しい配列の３’と５’の末端に相補的な配列３０merに制限酵素サイトとその足場3merをつけているだけです。 プライマーを設計するといっても、プライマーが欲しい配列と相補的でなかったら増えませんよね？あるいは、余分な配列が何塩基分か入ってしまいますよね？プライマーの設計の仕様がないと思ってしまうんですが・・・ あまりにも勉強不足の状態で質問してすみません。 いくら本を読んでもわかりませんでした。周囲でＰＣＲの経験者もいません。アドバイスお願いします。

全4件 ( 1 〜 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---