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マウスの免疫染色 削除/引用 No.58-8 - 2009/06/05 (金) 11:30:24 - まと 研究初心者です。現在、マウスのラ氏島移植の研究を行っております。 私は異種移植の系（ラット→マウス）で移植実験を行っているところですが 移植後のラ氏島グラフトに浸潤するリンパ球や好中球の免疫染色をしたいと思っています。マウスのCD4やCD8やCD68や好中球を染めるのにどこの社のどういった一次抗体，二次抗体を用いればよいか教えていただければ幸いです。（品番なども教えていただけないでしょうか？）サンプルはパラフィン切片を考えております。また簡単に免疫染色の流れなども教えていただければ幸いです。どうぞよろしくお願いいたします。

ありがとうございます 削除/引用 No.58-7 - 2009/02/22 (日) 18:06:23 - こがめいんこ 皆様、たくさんのご回答ありがとうございます。 まず多くの方からご指摘のラット二次抗体とマウス組織との交差反応についてです。今使用している二次抗体は、ネガコンの検討ではあまり大きな影響はないようです。 ただ、マウス組織にラット抗体はなるべく避けたほうがいいということなのですね。これまでラット由来の抗体はあまり使ったことがなかったので、大変参考になりました。 うーん様 >一次抗体をbiotin化したものを購入し直して、二次にHRP-avidinを購入すれば良いでしょう。 確かにこの方法なら二次抗体の交差を気にしなくてすみますね。大変勉強になります。 組織様 > ラボで免疫染色のプロトコールは確立されてますでしょうか。その組織を他の実績のある抗体で染めた場合、きちんとシグナルが確認できますか？ ご指摘のとおり、今のラボには組織免染の経験がある人がいなく、私自身も以前に多少かじった程度です… 今使っている組織では一応別の抗体でシグナルを確認しています。 ですので組織自体の問題というよりは、ご指摘いただいた点を含め、まだまだプロトコルの改善が必要かと考えています。 TK-1様 > そもそもパラフィンじゃなくてはいけないんですか。凍結切片で使える抗体の方が多いような気がします。 確かに凍結なら賦活化を気にしなくてすむと思うのですが、諸事情でホルマリン固定サンプルしか今手に入りません。 このサンプルで何とか染められたらと思うのですが、凍結サンプルを手に入れる手段も考えなくてはと考えています。 CJ様 > ABC法を使ったら３−５倍程度感度が高くなりますが、何で使わないのでしょう？内因性ビオチンが問題になる系ですか？ 当ラボでこれまで組織の免染経験がなかったせいか、Biotin-二次抗体がなく（HRP-二次抗体だけありました）、ABCやLSABができませんでした。 しょうもない理由かもしれませんが、ラボの事情で新しい試薬の購入が難しいのです… ただ、方法の変更で改善の可能性があるなら、購入交渉してみようと思います。 　 皆様、たくさんののご回答本当にありがとうございました。 多くのことを勉強させていただきました。

(無題) 削除/引用 No.58-6 - 2009/02/21 (土) 02:32:57 - CJ ABC法を使ったら３−５倍程度感度が高くなりますが、何で使わないのでしょう？内因性ビオチンが問題になる系ですか？

すみません 削除/引用 No.58-5 - 2009/02/20 (金) 11:59:43 - 組織 下に挙げた二次抗体は、マウスIgGの吸収処理をしているので、マウス組織中の形質細胞などとは反応しにくいというものです。

http:// 削除/引用 No.58-4 - 2009/02/20 (金) 11:16:53 - TK-1 > 他の方からもご指摘があるように、 というのは、anti-CD4もanti-CD8も両方がrat由来の抗体で、anti-ratを二次抗体を使うとどうなるかってことじゃないんでしょうか。 そもそもパラフィンじゃなくてはいけないんですか。凍結切片で使える抗体の方が多いような気がします。

(無題) 削除/引用 No.58-3 - 2009/02/20 (金) 10:56:04 - 組織 二次抗体に関しては、ニチレイからマウス組織用の抗ラット二次抗体が販売されてます。低バックグラウンドをうりにしているようです。私も使ってますが、造血系組織でもバックが出たことはないです。 http://www.nichirei.co.jp/bio/technical/protocol/meneki/simple_max/sensyoku_maxpo.html#p3_4 もし今お使いの二次抗体がマウス組織と反応しないものであれば変える必要はありません。メーカーのデータシートを確認してみて下さい。他の方からもご指摘があるように、造血組織の免疫染色ではFcレセプターと抗体との結合や、好中球などのミエロペルオキシダーゼによる非特異染色を想定しておく必要があります。このあたりは陰性対照をきちんとおくことで検討できると思います。 ただ書き込みを見ている限りでは、バックも含めて弱い染色しか得られていないようですので、まずはシグナルを強く出すことが先決でしょうね。ラボで免疫染色のプロトコールは確立されてますでしょうか。その組織を他の実績のある抗体で染めた場合、きちんとシグナルが確認できますか？ あとプロトコールでいくつか気になった点を上げておきます。ただし結果に大きく影響するところではないかもしれません。 >3%過酸化水素/メタノール メタノールを使う場合、過酸化水素は0.3%で十分です。 >8%スキムミルク(37℃,30min) →スキムミルクは5%、反応は室温30分で十分です。 >0.0025%トリプシン 37℃, 5-10min トリプシン濃度を0.1%くらいに上げた方が、賦活化効果が出やすいと思います。 反応時間も15-30minまで延ばしてみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.58-2 - 2009/02/19 (木) 22:36:40 - うーん >>二次抗体 HRP-conjugated (x500),RT,40min この場合、anti-rat 2nd antibodyってことですよね？ そりゃ難しくないですか？多少ハードル高いと思います。 大概のanti-ratはmouseにもcross reactしますからね。mouse由来のBCRが染色されちゃう恐れが。 それでやるより一次抗体をbiotin化したものを購入し直して、二次にHRP-avidinを購入すれば良いでしょう。

マウスリンパ球 CD4, CD8 免疫染色 削除/引用 No.58-1 - 2009/02/19 (木) 17:29:48 - こがめいんこ 免疫染色でマウス脾臓CD4陽性, CD8陽性リンパ球の区別をしたいと思っているのですが、染まる気配がありません。 サンプル：DBAマウス、脾臓、ホルマリン固定パラフィン包埋 CD4: abcam, rat monoclonal anti-CD4 (RM4-5) CD8: Santa Cruz, rat monoclonal anti-CD8 (JXYT8) 大まかな流れは、 　　抗原賦活化 　　3%過酸化水素/メタノール 　　ブロッキング　8%スキムミルク(37℃,30min) or 1%BSA(RT,30min) 　　一次抗体（x25-100）4℃,overnight 　　二次抗体 HRP-conjugated (x500),RT,40min 　　DAB発色 抗原賦活化方法はいろいろ条件を変えて試してみました。 　オートクレーブ120℃,10-15min（クエン酸バッファー、EDTAバッファー） 　0.0025%トリプシン 37℃, 5-10min　　　など 組織全体がごく薄くもやっと茶色くなるような状態です。 もしこの抗体でマウスリンパ球の染色をされている方がいらっしゃいましたら教えていただけると嬉しいです。 また、他にお勧めの抗体をご存知の方もお知らせいただければ幸いです。 よろしくお願い致します。

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