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(無題) 削除/引用 No.578-12 - 2009/06/01 (月) 04:30:49 - おお あ、失礼しました。分子量の解析は済まされているのですね。 でしたら、CO-IPでまずは大丈夫だろうと思います。 >[Re:11] おおさんは書きました : > >[Re:4] UKさんは書きました : > > 二量体形成ならば、適当なタグをつけて、Co-IPでも十分です。BiFC法は、confocalで解析すると、細胞内のどこで二量体が形成されているか確認できます。S様の研究のお役に立てば、幸いです。 > > COーIPは両者が一つのコンプレックスに存在することを > しめしますので2量体を正確に示すには考慮すべきこと > ほかの実験が必要です。 >[Re:10] おおさんは書きました : > >[Re:2] UKさんは書きました : > > BiFC (bi-molecular fluorescent complementation) 法というのがあります。ある分子A同士がホモ二量体を形成（分子間相互作用）していることを証明したいとき、使えます。A分子にYFPの断片をつけ、残りのYFP断片もA分子につけます（即ち、2種類のconstructsを作製します）。A同士がホモ二量体を形成（分子間相互作用）すると、YFP断片が相互作用し、YFPの蛍光が回復します。エレガントな方法ですので、試す価値はあると思います。 > > > 2量体だけでなく3、4、5量体といった物でもポジとでませんか? > ホモマルチマーと言えても、2量体とはいえないかもしれないと思ったのですが、、、 > >[Re:1] Sさんは書きました : > 興味を持っている分子が、ホモ二量体を形成している可能性を還元下、非還元下の分子量から得られました。ホモ二量体を形成しているか調べたいのですが、ダイレクトな証明法をお教え下さい。ある論文では、異なるタグを付けた分子(Myc-, FLAG-）をコトランスフェクションして、Co-IPで示している論文がありました。この方法で充分でしょうか。もし何か他の証明がありましたらお教え下さい。宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.578-11 - 2009/06/01 (月) 04:25:05 - おお >[Re:4] UKさんは書きました : > 二量体形成ならば、適当なタグをつけて、Co-IPでも十分です。BiFC法は、confocalで解析すると、細胞内のどこで二量体が形成されているか確認できます。S様の研究のお役に立てば、幸いです。 COーIPは両者が一つのコンプレックスに存在することを しめしますので2量体を正確に示すには考慮すべきこと ほかの実験が必要です。

(無題) 削除/引用 No.578-10 - 2009/06/01 (月) 04:22:03 - おお >[Re:2] UKさんは書きました : > BiFC (bi-molecular fluorescent complementation) 法というのがあります。ある分子A同士がホモ二量体を形成（分子間相互作用）していることを証明したいとき、使えます。A分子にYFPの断片をつけ、残りのYFP断片もA分子につけます（即ち、2種類のconstructsを作製します）。A同士がホモ二量体を形成（分子間相互作用）すると、YFP断片が相互作用し、YFPの蛍光が回復します。エレガントな方法ですので、試す価値はあると思います。 2量体だけでなく3、4、5量体といった物でもポジとでませんか? ホモマルチマーと言えても、2量体とはいえないかもしれないと思ったのですが、、、

(無題) 削除/引用 No.578-9 - 2009/05/31 (日) 13:37:43 - み >[Re:8] めんちんさんは書きました : > 私も目的で使い分けるという意見に賛成ですが、タンパク質の相互作用を証明するために蛍光の発色を観察するのは間接的だと思います。相互作用をyeast two hybridで証明するのに近いと思います。 > > もちろん良いとはおもうのですが、相互作用を証明することを第一にした実験系ではないとおもいます。 めんちんさんは単に二重染色をして二色のcolocalizationを見ることと誤解してるような文面に思えます。 UKさんが仰っているBiFCやそれに似たFRETなどは巧み（少し手の込んだ）な方法ですから証明の一つになるでしょう。でも立体障害などによりtagの付け方（スペーサーの長さなど）の微調整をしないといけない事態になるとうっとうしいので第一選択かどうかは疑問です。 細胞内での局在を併せて考えるならやる価値は高いでしょうが、myc, flagのIP-westernでもまあまあ納得させることはできるでしょう（controlをしっかりとって）。 その２量体形成によってウンヌンカンヌンと他の実験が続くのでしょうし、相補的に着目した現象論を証明していくのでしょうから。

(無題) 削除/引用 No.578-8 - 2009/05/31 (日) 13:06:36 - めんちん 私も目的で使い分けるという意見に賛成ですが、タンパク質の相互作用を証明するために蛍光の発色を観察するのは間接的だと思います。相互作用をyeast two hybridで証明するのに近いと思います。 もちろん良いとはおもうのですが、相互作用を証明することを第一にした実験系ではないとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.578-7 - 2009/05/30 (土) 19:13:13 - UK ＞なんとなく私のイメージではCo-IPの方BiFCよりも信頼できると思っていたのですが、UKさんの意見ではBiFC>Co-IPということでしょうか？ ＞それとも局在も見ることができることを除けば（相互作用の有無の確認のみであれば）BiFC=Co-IPということでしょうか？ BiFCとCo-IPの信頼性というよりも、実験の目的によって使い分けたり、併用するものだと考えています。

(無題) 削除/引用 No.578-6 - 2009/05/30 (土) 18:57:29 - ひよこ 便乗して質問させてください。 vivo（人によっては培養細胞はvitroと言うと思いますが）でのタンパクータンパク相互作用の証明にはCo-IPやBiFCが使われると思います。 なんとなく私のイメージではCo-IPの方BiFCよりも信頼できると思っていたのですが、UKさんの意見ではBiFC>Co-IPということでしょうか？ それとも局在も見ることができることを除けば（相互作用の有無の確認のみであれば）BiFC=Co-IPということでしょうか？ 強制発現の結果であればどっちもどっちなのかもしれませんが。。

(無題) 削除/引用 No.578-5 - 2009/05/30 (土) 16:05:28 - S UK様。ありがとうございます。異なるタグを付けた分子はたまたま既に作製してあったので、すぐにでも取りかかってみます。Co-IPで十分といことで安心しました。

追加ですが・・・ 削除/引用 No.578-4 - 2009/05/30 (土) 15:52:49 - UK 二量体形成ならば、適当なタグをつけて、Co-IPでも十分です。BiFC法は、confocalで解析すると、細胞内のどこで二量体が形成されているか確認できます。S様の研究のお役に立てば、幸いです。

(無題) 削除/引用 No.578-3 - 2009/05/30 (土) 15:39:45 - S BiFC (bi-molecular fluorescent complementation) 法ですか。初めて聞きました。すばらしくかなりはっきりした方法です。非常に参考になります。考慮に入れたいと思います。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.578-2 - 2009/05/30 (土) 08:18:49 - UK BiFC (bi-molecular fluorescent complementation) 法というのがあります。ある分子A同士がホモ二量体を形成（分子間相互作用）していることを証明したいとき、使えます。A分子にYFPの断片をつけ、残りのYFP断片もA分子につけます（即ち、2種類のconstructsを作製します）。A同士がホモ二量体を形成（分子間相互作用）すると、YFP断片が相互作用し、YFPの蛍光が回復します。エレガントな方法ですので、試す価値はあると思います。

ホモ二量体の証明 削除/引用 No.578-1 - 2009/05/30 (土) 07:28:41 - S 興味を持っている分子が、ホモ二量体を形成している可能性を還元下、非還元下の分子量から得られました。ホモ二量体を形成しているか調べたいのですが、ダイレクトな証明法をお教え下さい。ある論文では、異なるタグを付けた分子(Myc-, FLAG-）をコトランスフェクションして、Co-IPで示している論文がありました。この方法で充分でしょうか。もし何か他の証明がありましたらお教え下さい。宜しくお願いします。

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