いつも勉強させていただいております。
現在プラスミドの作製を行っているのですが、
発現を確認できない状況です。
インサートのデザインに問題があるとは思いたくないのですが、
自分の知識では、この状況を理解できません。
インサートを詳しく書きますと、
5-(足場3bp)(制限酵素サイト）(kozac)(atg-１ｘFLAG)(target gene)
・・・・・・stop(制限酵素サイト）（足場3bp)-3
です。
FLAGのついた発現ベクターが欲しかったのと、以前のベクターではstableが取れなかったため、そのプラスミドをテンプレートにして作製し、pZeoに入れました。
もちろんシークエンスを確認し、フレームシフト等起こっていないことは確認済みです。
リポフェクタミン2000で２９３T、COS-1にtransientで導入し、ウエスタンで確認ましたが、発現していない状況です。
FLAGの発現が確認できているプラスミド（これはｐｃDNA）をポジコンとして
同時にトランスフェクションし、ウエスタンで検出しましたがこちらはきちんと検出できています。
FLAGをつけているタンパクはウエスタンでも検出できるものです。
今回同じ手法で5種類のプラスミド（全てpZeo）を作製しましたが、全部発現が認められませんでした。
ということは、自分の作製方法に問題があるのではと思っています。
どなたかご教授ください。
よろしくお願いいたします。 |
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