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(無題) 削除/引用 No.566-12 - 2009/06/03 (水) 14:35:43 - たんぱく タンパクは薄すぎるとロスしたり失活しやすくなりますよ。 プルダウンに使うのなら、そのタンパク溶液にBSAを加えても良いと思います。 チューブやチップの吸着ロスや、コンタミしているプロテアーゼによる分解も防げます。 例えば、市販のサイトカインなどは少量、低濃度で売られていますが、ロスを防ぐために、キャリアータンパク（恐らくBSA）が添加されています。抗体の場合もそうです。

(無題) 削除/引用 No.566-11 - 2009/06/01 (月) 05:02:48 - おお でタージェンとはちょっと勇気がいりますが試す価値はあると思います。 アルギニンなどアミノ酸を加えるとタンパクが安定化するといった 報告もあるようです。 あとはそのタンパクのpIとバッファーpHが近い時たんぱく質は 沈殿する可能性が高くなるといわれています。pHを振ってみるのも てかもしれません。 凍結融解は融解時などの塩、バッファー成分の偏りが生じること もあり、なるべく速い凍結、融解をするほうがいいという 話もあります。 あと差し支えなければ精製後2ーMEかDTTを加えて おくと若干助けになる可能性はあると思います.

(無題) 削除/引用 No.566-10 - 2009/05/29 (金) 18:01:32 - ; 濃かろうが薄かろうが、凝集するときはします。

(無題) 削除/引用 No.566-9 - 2009/05/29 (金) 17:48:11 - haru ＞りょうさん 付け足しですが、精製後のタンパク質濃度は60μg/mlです。 それほど濃い濃度ではないと思います。

(無題) 削除/引用 No.566-8 - 2009/05/29 (金) 17:37:35 - haru ＞りょうさん ご意見ありがとうございます。 精製後のタンパク質は、pull down assayに用いる予定です。 少量なら反応にグリセロールを持ち込んでも大丈夫ではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.566-7 - 2009/05/29 (金) 13:22:18 - りょう ふと思いましたが，今回調製したタンパク質精製評品の濃度は如何程でしょう？ あまりに濃いと，塩かタンパク質のどちらかが析出してしまうのでは･･･ つまりは，生じた沈殿物はタンパクか否かということです。 溶解度の関係もあるでしょうし。 対策を取ったのなら，それはそれでいいのでしょうが， 今後の用途を考えた場合，言い方換えるとグリセロールで希釈というのはharuさんの場合適切ですか？ ちょっと気になったので，コメントしてみました。

(無題) 削除/引用 No.566-6 - 2009/05/28 (木) 20:30:24 - haru たくさんのご意見ありがとうございました。 ４℃保存では分解することはないのでしょうか？ グリセロールを混ぜてー２０℃で保存してみます。

(無題) 削除/引用 No.566-5 - 2009/05/28 (木) 18:20:44 - ひつじ トピ主さんと、同様に。 Hisタグ精製タンパクを凍結保存しています。 溶出バッファー(20mM K-phosphate, 300mM NaCl, 500mM imidazole)で、 -80℃保存しています。 凍結融解後に沈殿が見られるケース、見られないケースがあります。 精製タンパクの目的が、動物への抗体なので、問題がないのでしょうか？ 勉強不足で大変申し訳ないのですが。 気になったので投稿致しました。

(無題) 削除/引用 No.566-4 - 2009/05/28 (木) 13:10:25 - c 凍らせて凝集するなんてよくあることです。 タブーに近い。 問題なければ４℃で保存とか。

(無題) 削除/引用 No.566-3 - 2009/05/28 (木) 08:17:27 - たんぱく 凍結しないで、グリセロールを５０％になるように加えて−２０Cで保存してはどうでしょうか？ 硫酸アンモニウムで沈殿させた状態で４C保存でも比較的長期間安定ですが、塩濃度が高くなるので以後の実験に影響するかもしれません。 どうしても凍結したいのなら低濃度の界面活性剤をトライトンなどを加えるのも良いかと思います。

(無題) 削除/引用 No.566-2 - 2009/05/28 (木) 05:55:54 - ピペド 凍結保存条件を見直してください。 精製タンパクを何も考えずに凍結融解させるのは、典型的タブーのひとつです。 少なくともグリセロールなど凍結保護剤は必須でしょう。

精製したタンパク質の凝集 削除/引用 No.566-1 - 2009/05/27 (水) 21:38:54 - haru 初めてこちらを利用させて頂きます。 現在、Hisタグをつけたリコンビナントタンパク質を合成し、コバルトを配位した セファロースビーズ（TALONキット）を用いて精製しようとしています。 以下、簡単に手順を説明します。 平衡化バッファー（50mM Na-phosphate (pH7.0), 0.3M NaCl）をカラムに３回通し、 セファロースビーズを平衡化する。 ↓ サンプル添加 ↓ 平衡化バッファーを３回カラムに通し、目的以外のタンパク質を洗い流す。 ↓ 溶出バッファー（45mM Na-phosphate (pH7.0), 270mM NaCl, 150mM imidazole）で 目的タンパク質を溶出する。 全ての行程を室温で行い、各ステップ間で700x g、2分の遠心を行っています。 溶出したタンパク質を一度マイナス２０℃で凍らせ、４℃で融解したところ、タンパク質と 思われる物が沈殿していました。 精製したタンパク質が凝集しないようにするには、どうすれば良いでしょうか？ 自分では原因がわからず困っています。 ご意見よろしくお願い致します。

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