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(無題) 削除/引用 No.562-16 - 2009/05/28 (木) 21:42:06 - CJ >[Re:13] 苦労人さんは書きました : > >共同研究先からもらったプラスミドをもとにPCRで目的の配列を増やし、その際にプライマーの両端に制限酵素EcoR�T認識サイトをつけてインサートを得ます。 > > PCRせずに制限酵素のみで目的の配列を切り出す方法はないですか？ > 私はこの方法でプラスミド間でインサートの移しかえを行いました。ただ、元のプラスミドのコンタミを防ぐために、おのおののプラスミドが異なる抗生物質耐性である必要があります。

(無題) 削除/引用 No.562-15 - 2009/05/28 (木) 14:43:12 - AP >[Re:14] じゃーこさんは書きました : > インサートを増幅する際のプライマーは、リン酸化してあるのでしょうか？　 このケースでは末端を制限酵素消化するのでリン酸化は必要ないです。

(無題) 削除/引用 No.562-14 - 2009/05/28 (木) 14:14:25 - じゃーこ インサートを増幅する際のプライマーは、リン酸化してあるのでしょうか？普通に注文したプライマーはリン酸化されていません。 ベクター側を脱リン酸化しているようですが、その場合はインサート側にリン酸基が必要です。プライマーをリン酸化してからPCRするか、プロダクトをリン酸化してはどうでしょう？ その場合インサートが複数入ってしまう場合もありますが、今回の場合結構大きいサイズのようなので、ほとんどないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.562-13 - 2009/05/28 (木) 07:17:40 - 苦労人 >共同研究先からもらったプラスミドをもとにPCRで目的の配列を増やし、その際にプライマーの両端に制限酵素EcoR�T認識サイトをつけてインサートを得ます。 PCRせずに制限酵素のみで目的の配列を切り出す方法はないですか？

(無題) 削除/引用 No.562-12 - 2009/05/28 (木) 07:15:20 - 苦労人 >エクストラバンドを減らすためにプライマーを長くしてみたりもしましたが、余計エクストラバンドが出てしまいました。目的配列が2.5ｋｂｐもあるので仕方ないのでしょうか？ 2.5ｋｂｐは1回で取るには少し大きくないですか？ 2.5ｋｂｐの真ん中付近に適当な制限酵素があれば、二つに分けてPCRしたあと、ライゲーションして後からつなげるほうが早い場合もありますよ。 >プラスミドの方は脱リン酸化処理しています。 インサート側に脱リン酸化がかかってる可能性はないですか？

(無題) 削除/引用 No.562-11 - 2009/05/27 (水) 23:47:46 - UK ＞まず、ＰＣＲなのですが、エクストラバンドが多数出てきてしまって、様々に条件検討したのですが、エクストラバンドをあまり減らすことはできませんでした。 現在、持っているプラスミドから別のベクターへ載せかえは出来ますか？ ベクターを変えると、エクストラバンドが消えるなど、PCRの結果が劇的に改善されることがあります。

(無題) 削除/引用 No.562-10 - 2009/05/27 (水) 21:55:46 - AP >まず、ＰＣＲなのですが、エクストラバンドが多数出てきてしまって、様々に条件検討したのですが、エクストラバンドをあまり減らすことはできませんでした。よって、ゲルエクストラクションで目的のバンドだけを精製してインサートを得ています。(電気泳動で単一になっているか確認) 手法の説明が補足されてきたので、その点で問題になりそうなことを挙げると(これも過去トピで何度も指摘されていることですが) ・ゲルからの切り出し時のUV被爆によるピリミジンダイマーの形成。 ピリミジンダイマーをもつDNAはligationで環状プラスミドになっても、大腸菌内で複製不能なので、抗生物質耐性のコロニーが生えてきません。UVのdoseによっては、今回の実験のように、まったくリコンビナントがとれないということも簡単に起こりえます。 ・PCR終了後の末端の削れ込み。 とくに校正活性のある酵素だと、Exonuclease活性により3'端から末端が削れてしまって、プライマーにデザインした制限酵素認識配列が一本鎖になってしまって制限酵素が効かず、意図した付着末端ができない可能性があります。PCR後は速やかに精製、酵素活性の除去をする必要があります。PCRプログラムのお終いを4℃の保持にして、長い間放置するというのは好ましくないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.562-8 - 2009/05/27 (水) 17:39:13 - ~ PCRで目的のフラグメントが取れているのであれば、 今回はこれ以上PCRの条件をいじらなくてもいいと思います。 いろいろといじりようはあると思いますが。 >１６すべて空ベクターと同じ大きさのバンドがでました どの位の精度で空ベクターと同じサイズと判断したのでしょうか。 違うというのは示し易いですが、同じというのはなかなか確認が取れないと思いますが。 たとえば、実は使用しているのがウイルスベクターで、インサートは入ったが、デリーションも起こしてサイズが元のベクターと同じくらいになっているだけかもしれません。 適当に4つくらい選んで、EcoRIで切れるかどうかを確認すると、EcoRIのサイトが生きているかもわかりますので、 単なるセルフライゲーションであるのか、削れてライゲーションされたのかもわかるでしょう。 ただ、それをするよりも、インサートなしでライゲーションして、コロニーが生えるかどうかを見たほうが確実だと思います。 ネガコンには問題点がわからない場合には １．ベクターのみでライゲーションもしない ベクター側の切れ残りの混入の確認用 ２．インサートのみでライゲーションしない PCRのテンプレートのプラスミドの混入の確認用 ３．ベクターのみライゲーション 脱リン酸化の確認用 くらい用意すると、問題点の把握に役に立つと思います。

(無題) 削除/引用 No.562-7 - 2009/05/27 (水) 15:53:09 - ！ すみません、ＡＧＧＡＡＴＴＣのまちがいでした。 そして、大腸菌のコロニーですが、１：１：から１：２０までそれぞれ４つづつ１６のコロニーからプラスミドを抽出したところ、１６すべて空ベクターと同じ大きさのバンドがでました。 説明足らずですみません。勉強不足ですね。

回答ありがとうございます。 削除/引用 No.562-6 - 2009/05/27 (水) 15:46:49 - ！ まず、ＰＣＲなのですが、エクストラバンドが多数出てきてしまって、様々に条件検討したのですが、エクストラバンドをあまり減らすことはできませんでした。よって、ゲルエクストラクションで目的のバンドだけを精製してインサートを得ています。(電気泳動で単一になっているか確認) エクストラバンドを減らすためにプライマーを長くしてみたりもしましたが、余計エクストラバンドが出てしまいました。目的配列が2.5ｋｂｐもあるので仕方ないのでしょうか？ 次にライゲーションですが、確かにコントロールは取っていませんでした。セルフライゲーションによるものなのか、制限酵素での切れ残りなのか判断したいと思います。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.562-5 - 2009/05/27 (水) 15:44:34 - 中年 それから、「上手くいきません」だけではなくて、どう上手く行っていないかを書くと手がかりになりますよ。例えば下のような場合が考えられますが、実際にはどうなっているんですか？ ・形質転換体がほとんど出ない ・形質転換体は出るが、空ベクターばっかり（EcoRIで再切断できる） ・形質転換体は出るが、サイズは空ベクターに見えてもEcoRIで再切断できないものばっかり ・形質転換体は出るが、空ベクターより小さいサイズのプラスミドばっかり

(無題) 削除/引用 No.562-4 - 2009/05/27 (水) 15:36:36 - ### > プライマーは、フォワード：AGGAATT〜目的的配列Ｎ末から３０塩基、リバース：AGGAATT〜目的配列Ｃ末から３０塩基としています。 これはAGGAATTC〜の間違いですか？

Template 削除/引用 No.562-3 - 2009/05/27 (水) 15:22:11 - Primer 最初のPCRの際の鋳型として用いたplasmidは、PCR後に除いていますか？ この実験では、PCRがうまく行われているか。 制限酵素等の処理がうまくできているか。 形質転換ができているか。 と、いったようないくつかのステップを組み合わせたものなので、各段階がうまくいっていることを確かめることから始められるとよいと思います。 形質転換体がとれないからとライゲーション反応がおかしいと疑う前に、その前の段階も確認した方がよいと思います。 他人にデータをみてもらうときには、上記のようなことを確認しておくことが必要です。それでもうまくいかないこともあるので、そのときには別の方法をとるとよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.562-2 - 2009/05/27 (水) 15:09:54 - AP それだけの情報では、考え得る可能性はごまんとあって、何を言っても単なる当て推量になってしまいます。 以前のトピでもたびたび言われていることですが、ステップごとにコントロールをとらなければどこに問題があるかの見当もつけられません。 たとえば、インサートなしでligationあり・なしはやっていますか。出てきたコロニーはligationによって生じた環状ではなくて、もとから切れていない切れのこりが生えてきただけで、ligationやinsertは全くworkしていない可能性もあるわけで。ならばINSERTなしLIGATIONなしでも、 >１：１と１：５と１：１０と１：２０を試してみましたが、インサートがきちんと組み込まれたものはできていませんでした。 これと同等の結果かもしれません。

プラスミド作成 削除/引用 No.562-1 - 2009/05/27 (水) 14:48:36 - ！ プラスミドを作成しようとしています。 共同研究先からもらったプラスミドをもとにPCRで目的の配列を増やし、その際にプライマーの両端に制限酵素EcoR�T認識サイトをつけてインサートを得ます。それを市販のプラスミドに組み込もうとしているのですが、どうしても上手くいきません。 プライマーは、フォワード：AGGAATT〜目的的配列Ｎ末から３０塩基、リバース：AGGAATT〜目的配列Ｃ末から３０塩基としています。GAATTCというのが制限酵素EcoR�Tの配列です。AGをつけたのは、その方が制限酵素で切れやすいと聞いたからです。このプライマーでＰＣＲで目的配列を増やし、市販のプラスミドとインサートをEcoR�Tで切って、ライゲーションしました。プラスミドの方は脱リン酸化処理しています。プラスミド対インサートは、１：１と１：５と１：１０と１：２０を試してみましたが、インサートがきちんと組み込まれたものはできていませんでした。 原因がわかりません。おそらく、ＰＣＲの段階でインサートに問題があるのではないかと考えています。 御助言頂けたら幸いです。

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