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(無題) 削除/引用 No.562-36 - 2009/06/04 (木) 15:48:00 - おお 机上の空論好きです。 机上の空論でも、ベターであると判断できるものは ありますし、机上の空論でPCRのサイクル数が多いと よくないことが起こると想像できるなら、30も回さないで 取れるんであれば下げた方がスッキリしますし、 転ばぬ先の杖にはなると思います。 もちろん色々な原因で(たとえばプライマーを設定 する所が固定されていて、どうしてもかなり非行率 なプライマーを使わざる終えないとか)30クラい 回さないとちゃんと取れないなら回して良いと思いますが。 実験一つひとつ熟考することはいろいろな意味で訓練になる とおもいますよ。

(無題) 削除/引用 No.562-35 - 2009/06/03 (水) 04:02:06 - 苦労人 >しかし、ベクターマップ詳細不明なため、余分な良くわからない配列がインサートと一緒に切り出されてしまう点と、ちょうどベクターとインサートが同じ様なｂｐで切られるため、ゲルで流した時にバンドの一部が重なってしまって精製が困難であるという２点のためにＰＣＲを用いる方法を考えました。 ベクターマップの詳細が不明といっても、バークボーンのベクターが何かなどの最低限の情報はあるのでしょうか？そういう情報があるなら、10パターンくらいの組み合わせ(内部に存在するもの、内部に存在しないもの、その両方などいろいろなパターン)で制限酵素処理を行って、切り出されたサイズをみると、非常におおざっぱなベクターマップが作成できるので、インサートを切り出せる酵素や、インサートの方向程度の情報は得られることが多いです。それで、あり得ないパターンが出たなら、プラスミドがおかしいという事が証明できます。

(無題) 削除/引用 No.562-34 - 2009/06/02 (火) 02:41:57 - あべちゃん >[Re:29] ?さんは書きました : > サイクル数が多すぎるとか、４℃で置いておくとダメとか > 実際、それで問題あった人っているのでしょうか？ > > あまりに机上の空論すぎると思いますが。 > > 私はその酵素でどっちの条件もいつもやっていますが、そんな経験ありません。 > いくら考えられるからといって、机上の空論の知識をひけらかしても > 質問者さんを無駄に迷わせるだけじゃないですか？ ずいぶんざっくりと言われてしまいましたので、トピ主さんには、恐縮ですが私の考えを言わせてください。 ？さんは、無責任だと切り捨てましたが、面識のない人を相手に掲示板で限られた条件で意見を交換するのですから、責任なんて、そもそも存在しないと思います。 それでも、その限られた話の中で、自ら経験したり聞いたりした情報を提示することで、トピ主さん或いは掲示板を見ている人の役に立てればぁと思って、thermal cyclerでO/Nほったらかしにすると、high fidelity polymeraseの場合、削り込みが起きる可能性があると述べました。 今回のトピ主さんにとって、不必要な情報かも知れません。でも、IT時代と呼ばれて久しいですが、良くも悪くも情報がたくさんある世の中で、自分に必要な情報を取捨選択する能力も社会人として必要なスキルだと思います。 掲示板で、トピ主さんにとって、何が必要な情報で、何が不必要かなんて、本人以外に分からない以上、自らの知りうる情報を提示することに何ら悪いことはないと思います。

(無題) 削除/引用 No.562-33 - 2009/06/01 (月) 21:17:23 - CJ スレ違いですが ?さん たしかに経験豊富な人が周りにたくさんいれば「こんなところ」に書き込む必要はないんでしょうが…。 ここに書き込んでいる人の多くが、匿名掲示板の限度というものを理解していると思いますし、皆が皆？さんのように人的に恵まれた環境で研究できているとは限らないのです…。私はここが「こんなところ」とけなすようなところではないと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.562-32 - 2009/06/01 (月) 16:41:31 - AP >サイクル数が多すぎるとか、４℃で置いておくとダメとか >実際、それで問題あった人っているのでしょうか？ 過去ログ読んでください。自分にそういう経験がないから（それに気がついていないだけかも）という論拠で、机上の空論だというのが、まさに机上の空論。

(無題) 削除/引用 No.562-31 - 2009/06/01 (月) 14:39:16 - ？ 非特異バンドの原因なんて、私にはわかりません。 そもそも質問者さんの実験の力量がどれほどのものかわからないのに、 実験の環境も何もわからないのに、アドバイスできる方がおかしいと思います。 ただ、こういうことをしたら、こういうことがあったという実体験は言えます。 その実体験を私は言うことが私はここでの書き込みかと個人的には思いますので。 これは個人的なので、別にどうでもいいです。 ＞サイクル数ではありました。 プラスミドがテンプレートの場合によくやる失敗だと思いますけど。 あったのなら、それを言えば参考になると思います。 ただ、よくやる失敗というのはあくまで主観で想像では？ 私がこれまでわたってきた３つの研究室では、それはよくやる失敗ではありませんし。 よくやる失敗だ、ということ、と、 そういう人もいた、ということ これで印象が変わり、参考にしようかなと思うか、 絶対にそれをすべきだと他に目を配らずそれだけをやるようになるか、 わかってくると私は思いますので。 人の動きを変えるかもしれないのに責任感も無く書き込むということはどうかと。 だから、実体験を書き込んだ方が良いかと。 私が言えることは１つだけです。 こんなところで聞くより、身近にいる同僚や先輩に教えお乞いながら解決すべき。 それが一番なことだし、現場にしかわからないことがある。

(無題) 削除/引用 No.562-30 - 2009/06/01 (月) 14:21:47 - ~ >[Re:29] ?さんは書きました : > サイクル数が多すぎるとか、４℃で置いておくとダメとか > 実際、それで問題あった人っているのでしょうか？ サイクル数ではありました。 プラスミドがテンプレートの場合によくやる失敗だと思いますけど。 問題が起きていないのであれば別にいいのですが、 非特異がたくさん生じていて、その原因を探りたいというのであれば、 原因の候補を答えるべきでしょう。 >質問者さんを無駄に迷わせるだけじゃないですか？ 質問者さんにはPCRよりも他に力を使うべきだと伝えています。 それでも質問者さんが原因を知りたいというのであれば、 原因の候補を伝えることはおかしくはないでしょう。 目的のベクターができればOKではなく、きちんと各ステップの問題を解決しておきたい人なのでしょう。 逆に?さんは、質問者さんの非特異のバンドの原因は何と考えて、その対処法は何だと考えているのですか？ トラブルを経験していない人がそんな経験はありませんといっても、質問者さんの非特異のバンドは消えないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.562-29 - 2009/06/01 (月) 14:01:43 - ? サイクル数が多すぎるとか、４℃で置いておくとダメとか 実際、それで問題あった人っているのでしょうか？ あまりに机上の空論すぎると思いますが。 私はその酵素でどっちの条件もいつもやっていますが、そんな経験ありません。 いくら考えられるからといって、机上の空論の知識をひけらかしても 質問者さんを無駄に迷わせるだけじゃないですか？

(無題) 削除/引用 No.562-28 - 2009/05/29 (金) 21:29:28 - あべちゃん >[Re:26] ！さんは書きました : さらに夜にオーバーナイトで４度保存の状態で次の日に精製していました。 > これが問題ですかね・・・ ええ、これは問題です。 校正機能のあるポリメラーゼでO/Nのほったらかしは、削り込む可能性が高いですね。インサートがあっても、EcoR1サイトの一部が削れてしまって、カットできないのかもしれません。 でも、これだけで全く出なくなると言うのも考えにくいので、これだけ原因とも言い切れませんが。

(無題) 削除/引用 No.562-27 - 2009/05/29 (金) 17:19:44 - ~ >ＫＯＤを使ってサイクルを３０サイクルも回していて 4oCがどうという以前に、サイクル数が多すぎると思います。 仮に、10ng/uL位の原液を1,000倍希釈して、1uLをテンプレートとして持ち込んだ場合、1pg/vialとなります。 (特に書かれていませんので、おそらくこれよりも薄くしてはいないような気がします) 概算で2^30=10^9倍に増えることになりますが、 1mg/vialになるのは無理でしょう。 サイクルの後半は、適当に熱変性、アニールが繰り返され、 おかしなものが生じるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.562-26 - 2009/05/29 (金) 15:59:29 - ！ 一度、供与してもらったベクターの配列を読んでみたいと思います。 ＰＣＲなのですが、アニーリング温度やテンプレートの濃度など、様々な条件検討をしました。ただ、ＫＯＤを使ってサイクルを３０サイクルも回していて、さらに夜にオーバーナイトで４度保存の状態で次の日に精製していました。 これが問題ですかね・・・

(無題) 削除/引用 No.562-25 - 2009/05/29 (金) 14:53:29 - pi 見当違いかもしれませんが、もともとプラスミドがいかれているということはないですか？確認はされてますでしょうか。 昔、供与していただいたプラスミドからＰＣＲでサブクローニングしようとしたとき、質問者様と同じようにエキストラバンドが多数出てくることがあり、大きさで判断して強引にプラスミドに放り込んだのですが、まったくわけのわからないものが取れてしまったことがありました。 結局シークエンスで確認したところ、もとのプラスミドがわけのわからんものになってしまっていたようです。

(無題) 削除/引用 No.562-24 - 2009/05/29 (金) 14:50:01 - ~ >手技でそんなにもエクストラバンドって増えてしまうものなのでしょうか？ そこが問題なのでしょうか？ とりあえず回収できているのであれば、ほかに力を入れるべきところは多いと思いますが。 思いつくエクストラバンドの原因としては、 １．サイクルの回しすぎ 　何サイクルまわしているかわかりませんが、プラスミドがテンプレートであれば10サイクルは回しすぎだと思います。 ２．アニーリング温度が低すぎ 　非特異が消えるまでアニーリング温度を上げる。 ３．プライマーの3'側の配列にアニールする配列がある。 　プライマーの位置をずらしたりする。 また、プラスミドを鋳型とした場合であれば、あまりお勧めしませんが、 PCR→アガロース電気泳動後に、目的のバンドの部分をチップでつんつんして、 それをPCRのテンプレート以外が入った溶液につけて、2nd PCRを回すという方法もあります。 ただ、非特異に増えるのが、インサートの内部であれば、あまり効果はないでしょう。

みなさん、ありがとうございます。 削除/引用 No.562-23 - 2009/05/29 (金) 13:26:11 - ！ 実は、共同研究先から「ずいぶん前に作成したプラスミドなので詳細なベクターマップがわからない。」と言われてしまいまして、苦労しています。インサートなのですが、2.5ｋｂｐで結構いろいろな制限酵素で切れてしまうんです。空ベクターの方に存在し、かつ目的配列が切れないような制限酵素を選ぶとＥｃｏR1一種類になってしまいます。 インサートの精製なのですが、ＱＵＩＡＧＥＮのＧＥＬ　ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮというキッドを用いてＵＶを使わずにゲルがら切り出しているので、ピリジンダイマーなどが生じている可能性は低いと考えます。 また、私は単にベクターの入れ替えをしたいだけなので、もらったプラスミドから制限酵素でインサートを切り出し、直接空ベクターに入れる方法を当初は取ろうと思っていました。しかし、ベクターマップ詳細不明なため、余分な良くわからない配列がインサートと一緒に切り出されてしまう点と、ちょうどベクターとインサートが同じ様なｂｐで切られるため、ゲルで流した時にバンドの一部が重なってしまって精製が困難であるという２点のためにＰＣＲを用いる方法を考えました。 確かに、私はＰＣＲ初心者なのですが、手技でそんなにもエクストラバンドって増えてしまうものなのでしょうか？同僚や先輩からもアドバイスをもらっているのですが・・・ 一応、その人達に同様の実験をやってみてもらう様頼んでみますね。 筆末ながら、皆さんたくさんの御助言感謝いたします。

(無題) 削除/引用 No.562-22 - 2009/05/29 (金) 12:56:53 - NdeI 自分は制限酵素サイトはプライマーの真ん中に入れてます。 fastpcrというソフトで非特異増幅が無いか（おまじない程度に）確認してから注文しています。

(無題) 削除/引用 No.562-21 - 2009/05/29 (金) 11:09:37 - 結局 ここで文字だけを見てどうこう言ってもしょうがない。 身近にいる人に実践で教えてもらいことです。 出来る人が全くいないってことはないでしょう？ それが出来ない人間関係であるのなら、まずはそれを修復することが何よりも大事。

横レスですが 削除/引用 No.562-20 - 2009/05/29 (金) 10:59:29 - ~ >み　さん >ちなみに質問者以外の人はどんな感じでやっておられるのですか？ NEBのカタログの後ろのほうに載っている配列をそのまま使っています。 そこに載っていない制限酵素認識サイトを付加したことがありませんが、 もし情報の無い制限酵素を使う必要が出てくれば、PCR産物をそのまま切らずに、 一度クローニング用ベクターに入れてから切ります。

(無題) 削除/引用 No.562-19 - 2009/05/29 (金) 10:31:04 - み 共同研究者からもらったプラスミドをtemplateにして、ＰＣＲをかけているのにextra bandがいっぱい出るという時点で腕を疑ってしまいますが。 他のコンストラクションは問題ないのでしょうか（経験豊富なのか）？ 下手な人がやると2-3kbを越えると入らなくなったりしますからね。 コロニーピックアップ16個ですか。勿論上手い人がやれば4個でも安心ですが、下手な人がやってたら・・・。 同僚で手が動かせる人はいないのでしょうか？ 本質ではないでしょうが、プライマー設計について、僕は制限酵素サイトの前にggg３塩基付加します。 ２塩基では経験ないです。 ちなみに質問者以外の人はどんな感じでやっておられるのですか？

(無題) 削除/引用 No.562-18 - 2009/05/29 (金) 09:55:39 - ~ もし時間がかかるようであれば、 PCR産物の末端の制限酵素処理やベクターの脱リン酸化などが怪しいとにらんで、 Tベクターに入れてしまってはいかがでしょうか。 (PCR産物の末端にAが付く酵素であるかの確認が必要ですが) Tベクターに入れて、シークエンスまで読んでしまえば、 PCRで生じた非特異な増幅産物に悩まされること無く、EcoRIで切り出せます。 (Teasyの場合はベクター自体にもEcoRIサイトがありますが、きちんと切れば問題ないでしょう) 一度読んだ配列を切り貼り目的のベクターに入れ直した際には、シークエンスを読み直さない方針の人も結構いるようです。 (私は読みますが) それをやりながら、本来入れたいベクターの調整、セルフが生じるかの確認などを進めてはいかがでしょうか。 市販のTeasyであれば、セルフはほとんど生じません。 インサート無しと同じくらいしかコロニーが生じないのであれば、PCR産物の調整がおかしいでしょう。 PCR産物の精製、特に切り出しにUVを使っていればUVによるダメージが疑わしいと思います。

(無題) 削除/引用 No.562-17 - 2009/05/29 (金) 02:50:30 - じーら 一般的な「こつ」 primerの末端「きりしろ」はもう少し長めのほうが効率はいいかも。 EcoRI　は文献的には２ merで十分だけどね。 　AGAGGAATTCーーーーー PCRで増やすのであればEcoRI--insert--EcoRIではなく、他の酵素が使えなかったのか？ insertも長めとはいえ、それほど制限酵素サイトばかりならんでいるわけではないでしょう？ もしベクターにEcoRIとBamHIがあって使えるとしたら、EcoRI-BamHIのprimerを用意しておいておけば、vectorのみのコロニーは通常は激減します。 エチブロで切り出しをするよりはSYBR Greenなどの長波長系の蛍光試薬を使った方が圧倒的にサブクローニングの効率はいいです。SYBR Green専用のイルミネーターがなくともUVイルミネーターでできるし、それでも効率はいい。

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