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ありがとうございます。 削除/引用 No.550-5 - 2009/05/27 (水) 20:22:29 - かわさき おお様、小児科医師（ゆとり教育）様、コメントありがとうございます。 ＞上記のすべてで共通して使える可能性があるのは、ハイポトニックな 溶液で細胞を壊して、超遠心です。 ハイポトニックで壊したとき、1000gぐらいの遠心で核を除けば 上澄みには膜がフラグメント化しみせるになったものと、サイトゾル の内容物が混在しています。 このフラクションを超遠心で落とすと膜のフラグメントとサイトゾルが わけれます。このペレットを回収しまくフラクション、上澄みをサイトゾル とすればいいかと思います。超遠心出なくとも最近の性能のいい 高速冷却遠心機でガンガンに回せばかなり膜が回収できるとは 思いますが、完全ではないかもしれません。 誠にあつかましいのですが、もし差し支えないようでしたら具体的な手順が記載されたネット上のページとか教えていただくわけには行きませんでしょうか？私なりに手元のタンパク関連参考書を読んだのですが、細胞膜タンパクの抽出法についての記載はあっても、細胞質タンパクの抽出法についての記載はありませんでした。なにしろ核酸の実験がメインだったものですから、タンパクの知識がすかすかなのです。 MEM-PERについては小児科医師（ゆとり教育）様がリンク張っていただいておりましたので、見させていただきましたが、細胞質タンパクについて積極的に抽出するようには記載されておりませんでした。（本当は取れるのかも知れませんが・・・。）

(無題) 削除/引用 No.550-4 - 2009/05/26 (火) 10:31:00 - 小児科医師（ゆとり教育） 下のようなキットがあります。 Mem-PER® Eukaryotic Membrane Protein Extraction Kit http://www.funakoshi.co.jp/node/13755 このトピックも参考になりそうです。 ある蛋白が細胞膜にあるかどうかを調べるには？ http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi mode=view;Code=565

(無題) 削除/引用 No.550-3 - 2009/05/26 (火) 03:57:57 - おお >[Re:1] かわさきさんは書きました : > 自分なりに考えますと、染色体FISHを行なうときのように、低調バッファーで細胞をパンクさせれば、上清に細胞質タンパクが、適切な界面活性剤入り可溶化バッファーで溶かせば、上清に細胞膜タンパクが取れるのではと考えております。 細胞を界面活性剤いりバッファーで処理すると、膜タンパクは溶出 できますがサイトゾルのフラクションも一緒に混ざった状態です。 低調溶液での処理は先の書き込みを参考にしてください。

(無題) 削除/引用 No.550-2 - 2009/05/26 (火) 03:49:58 - おお 膜タンパクというのが微妙な表現ですが、色々な様式で膜に存在している 可能性があります。 1)膜にタンパク自身が埋もれている。 2)たんぱく質が脂質など疎水せいの強いもので修飾をうけ膜にアンカリングされている。 3)たの膜局在タンパク質に相互作用することによってまくにそんざいする。 3)の場合交互作用は比較的弱く、界面活性剤や塩濃度、pH、Ca/Mgの存在 などを選ぶ可能性があります。 上記のすべてで共通して使える可能性があるのは、ハイポトニックな 溶液で細胞を壊して、超遠心です。 ハイポトニックで壊したとき、1000gぐらいの遠心で核を除けば 上澄みには膜がフラグメント化しみせるになったものと、サイトゾル の内容物が混在しています。 このフラクションを超遠心で落とすと膜のフラグメントとサイトゾルが わけれます。このペレットを回収しまくフラクション、上澄みをサイトゾル とすればいいかと思います。超遠心出なくとも最近の性能のいい 高速冷却遠心機でガンガンに回せばかなり膜が回収できるとは 思いますが、完全ではないかもしれません。 もう一つの方法はTRITON X114を使う方法です。この界面活性剤は常温以上では その能力を持たず、沈殿(水と2相分離)します。低温では界面活性剤として 使えますので低温で細胞を溶解して、核フラクションを除いてから、 30度とか(温度ははっきり覚えてないので確認してください)で遠心すると 膜とサイトゾルのフラクションが分けれます。確かピアズのMEM-PERも 同じようなわけかただったような気がします。 この方法は上記1)や2)の場合は先ずは大丈夫でしょうけど、3)の場合は 若干不安があります。

細胞質タンパクと細胞膜タンパクの分画とり 削除/引用 No.550-1 - 2009/05/25 (月) 21:34:00 - かわさき いつも勉強させてもらっています。細胞質タンパクと細胞膜タンパクの分画とりについてお聞きしたいと思います。一応過去トピは検索いたしましたが、該当するものはありませんでした。どうかよろしくお願いします。 ある遺伝子をノックダウンすると免疫染色上、いくつかの細胞膜タンパクが細胞質に移動したように見えます。正確には移動したというよりはノックダウン後に新たに発現したタンパクは細胞膜に移動できないという感じなのですが、そのことを論文で言う為には免疫染色だけではちょっと説得力不足ですので、タンパクの分画をとってウエスタンで言いたいと思います。そこで表題のとおり、細胞質と細胞膜の分画をとり分けたいと思いますが、恥ずかしながらこれまでそのような生化学的実験を行なった経験がなく、いくつかの参考書をあたったのですがこの目的に見合うプロトコールが見つけられませんでした。 自分なりに考えますと、染色体FISHを行なうときのように、低調バッファーで細胞をパンクさせれば、上清に細胞質タンパクが、適切な界面活性剤入り可溶化バッファーで溶かせば、上清に細胞膜タンパクが取れるのではと考えております。 探したところメルクからにSubcellular ProteoExtract Kitというのも売られておりますが、完全に分画できるわけではないようです。（そんなものないとは思いますが） どなたか、この件につきご存知であれば、ご教授のほどよろしくお願い申し上げます。

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